Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

التمويل المقدم من المعهد الوطني للعيون [5K08EY027850]، المعهد الوطني لصحة الطفل ونمائه [U54HD090255]، برنامج هارفارد فيجن لتطوير العلماء السريريين [5K12EY016335]، مؤسسة فرسان تمبلر للعيون [بداية مهنية] منحة] ومؤسسة طب العيون في مستشفى الأطفال [جائزة اكتشاف الكلية]. اللجنة الاقتصادية لأوروبا هو محقق معهد هوارد هيوز الطبي.

تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية الموصوفة هنا وتنفيذها وفقا لبروتوكولات لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال.
1. التزاوج في الوقت المناسب
<ol><li>مكان ISLMN:GFP (جزيرة الخلايا العصبية الحركية بروتين الفلورسنت الأخضر; MGI: J:13272...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

يوفر هذا البروتوكول ثقافة شريحة الجسم الحي السابق مزايا كبيرة على الاختبارات التوجيه axon التقليدية23. حجم كل نواة المحرك القحفي ليس عاملا ً مقيداً، وليس من الضروري إجراء تشريح صعب. البيئة الدقيقة الذاتية التي يتم من خلالها الحفاظ على مسارات المحاور، مما يسمح بتعديل مسار إشارة ...

يوفر نظام المحرك العيني نظام أنيق للتحقيق في آليات توجيه أكسون. وهو غير معقد نسبيا، ويتألف من ثلاثة أعصاب الجمجمة innervating ستة عضلات خارج العين (EOMs) التي تحرك العين، وlevator palpebrae superioris (LPS) الذي يرفع الجفن. العصب الحركي الداخلي LPS وأربعة EOMs - المائل السفلي والعضلات الوسيطة، السفلي، والمستقيمة متفوقة. أما الأعصاب الأخرى، وهي التروكلير وعبدهسين، فكل منهما يُعد عضلة واحدة فقط، وعضلة مستقيمة مائلة وجانبية متفوقة، على التوالي. توفر حركات العين قراءة سهلة، تظهر ما إذا كان التداخلي مناسبًا أو مفقودًا أو شاذًا. بالإضافة إلى ذلك، هناك اضطرابات حركة العين البشرية التي تنتج عن العجز في تطوير الخلايا العصبية أو توجيه axon، ويطلق عليها مجتمعة اضطرابات التأذيب القحفي الخلقية (CCDDs)1.
على الرغم من هذه المزايا، ونادرا ما يستخدم نظام السيارات العين في الدراسات التوجيهية axon2،3،4،5،6،7،8، 9 , 10، وذلك بسبب العيوب التقنية. في المختبر axon التوجيه الاختبارات لديها العديد من العيوب11. اختبار الثقافة المشتركة، التي يتم فيها زراعة explants الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع explants من الأنسجة المستهدفة12 أو الخلايا المنقولة13، تعتمد على كل من التماثل من explant وتحديد المواقع دقيقة بين explant والأنسجة المستهدفة. شريط الاختبارات14،15، التي يتم وضع اثنين من العظة في المشارب بالتناوب ويتم تقييم المحاور للنمو التفضيلي على شريط واحد، تشير فقط إلى أن الركيزة واحدة هي الأفضل من الأخرى، وليس أن أي منهما جذابة أو مثير للاشمئزاز، أو ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. غرف Microfluidics يمكن أن تشكل التدرجات الكيميائية الدقيقة، ولكن موضوع المحاور المتنامية لالقص الإجهاد16،17،18، والتي يمكن أن تؤثر على نموها. وعلاوة على ذلك، في كل من هذه النهج، يتطلب جمع النباتات الخارجية أو الخلايا المفككة أن تكون المحاور المتناجة، وبالتالي فإن هذه الاختبارات تدرس في الواقع تجديد أكسون، بدلاً من نمو المحاور الأولي. وأخيراً، فإن هذه النُهُج في المختبر تزيل البيئة الدقيقة التي تؤثر على المحاور واستجاباتها للإشارات على امتداد نقاط مختلفة من مسارها، وتختبر عادة إشارة واحدة فقط في عزلة. ومما يضاعف من هذه العيوب، أن صغر حجم كل نواة في نظام المحرك العيني يجعل التشريح صعباً من الناحية التقنية إما بالنسبة للنباتات المنقطعة أو الثقافات المفككة. بالإضافة إلى ذلك، الثقافات الأولية للخلايا العصبية الحركية العينية عادة ما تكون غير متجانسة، لديها موت خلايا كبير، وتعتمد على الكثافة، مما يتطلب تجميع الخلايا من أجنة متعددة (Ryosuki Fujiki، الاتصال الشخصي). في طرق الجسم الحي، ومع ذلك، بما في ذلك نماذج الماوس خروج المغلوب، غير مناسبة للاستخدام للفحص، نظرا للوقت والنفقات المطلوبة.
الطرق التي تم تطويرها لثقافة الأجنة الكاملة19 تسمح بوسم الخلايا المهاجرة20 أو حصار جزيئات محددة21، ولكن الثقافات الجنينية كلها تتطلب الحضانة في زجاجات الأسطوانة التي تحول دون التصوير في الوقت الحقيقي من المسمى الهياكل. التقنيات الجراحية التي تسمح بالتلاعب في الجنين ومن ثم مزيد من التطور اللاحق إما في الرحم أو في بطن الأم (الحفاظ على اتصال المشيمة)22 ممكنة أيضا، ولكن هذه أيضا لا تسمح بفاصل زمني التصوير.
للتغلب على العقبات من الاختبارات في المختبر والسماح بالفحص السريع لمسارات الإشارات، تم تطوير تقنية ثقافة الشريحة الجنينية من الجسم الحي السابق23، مقتبسة من بروتوكول نشر سابقا لنمو الأعصاب المحيطية24. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تصوير العصب الحركي النامي مع مرور الوقت في وجود العديد من الهياكل المحيطة على طول مساره، بما في ذلك أهداف EOM. من خلال إضافة مثبطات جزيء صغير، وعوامل النمو، أو العظة التوجيه إلى وسائل الإعلام الثقافة، يمكننا تقييم الاضطرابات التوجيه في نقاط متعددة على طول مسار محور محور محور، مما يسمح بتقييم أسرع للنمو المحتمل ة وعوامل التوجيه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

حركات العين دقيقة حاسمة للرؤية، ولكن تطوير نظام المحرك العين، وخاصة المسارات الجزيئية التي تسيطر على توجيه محور عصبي، لم يتم توضيحها بشكل كامل. ويرجع ذلك جزئياً إلى القيود التقنية على الاختبارات التقليدية لتوجيهات المحاور. لتحديد إشارات توجيه axon إضافية تؤثر على العصب oculomotor، تم تطوير اختبار شريحة الجسم الحي السابق لتصوير العصب الحركي في الوقت الحقيقي كما ينمو نحو العين. E10.5 يتم استخدام الأجنة Isl MN-GFP لتوليد شرائح الجسم الحي السابق عن طريق تضمينها في أغاروز، وتقطيعها على الاهتزاز، ثم زراعتها في حاضنة مجهر المرحلة أعلى مع التصوير المجهري الفاصل الزمني لمدة 24-72 ح. في توقيت الجسم الحي من نمو المحاور من النواة إلى المدار. يمكن إضافة مثبطات الجزيئات الصغيرة أو البروتينات المؤتلفة إلى وسائل الإعلام الثقافية لتقييم دور مسارات توجيه المحاور المختلفة. هذه الطريقة لديها مزايا الحفاظ على المزيد من البيئة الدقيقة المحلية التي من خلالها المحاور اجتياز، وليس الساكسوتوميس المحاور المتنامية، وتقييم المحاور في نقاط متعددة على طول مسارها. كما يمكن أن تحدد الآثار على مجموعات فرعية محددة من المحاور. على سبيل المثال، تثبيط CXCR4 يسبب المحاور لا تزال داخل الدماغ المتوسط لتنمو الظهرية بدلا من فينرالي، ولكن لا تتأثر المحاور التي خرجت بالفعل ventrally.

النتائج العادية: يوفر الشكل 1 مخططًا للتجربة. بدءا من وقت مبكر من E9.5 في الماوس، تبدأ المحاور الأولى في الخروج من نواة oculomotor26. بواسطة E10.5، يمكن رؤية العصب الحركي اللفاف، الذي يحتوي على الخلايا العصبية الرائدة في وقت مبكر، في mesenchyme. هناك تباين كبير بين الأجنة في E10...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

يسمح فحص شريحة الجسم الحي السابق بالتصوير في الوقت الحقيقي. يتم إنشاء شرائح عن طريق تضمين E10.5 IslMN: GFP الأجنة في agarose، وتقطيع على الاهتزاز، وتنمو في حاضنة المرحلة العليا. يتم تقييم دور مسارات توجيه axon عن طريق إضافة مثبطات إلى وسائل الإعلام الثقافية.

السابق فيفو أوكولوموتور شريحة الثقافة من الفئران الجنينية GFP التعبير عن التصوير الفاصل الزمني من نمو الأعصاب أوكولوموتور

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

يسمح لنا هذا البروتوكول بتحديد مسارات التوجيه المحوري النشطة في العصب المُنمُرّح وتقييم أدوارها في نقاط مختلفة على طول المسار العصبي في الوقت الحقيقي. هذه التقنية تحافظ على البيئات المحلية التي من خلالها محاور السفر وأهدافها النهائية. لا يتم قطع المحاور المتنامية ، لذلك يمكن تقييم محور عصبي أولي ، بدلاً من التجديد.توفر هذه الطريقة رؤى في توجيه محور عصبي في نظام المحركات العينية ولكن يمكن تكييفها لدراسة توجيه محور عصبي للأعصاب الأخرى. هذه التقنية يأخذ الممارسة لإتقان، والعمل بسرعة هو في غاية الأهمية. عند محاولة ذلك لأول مرة، واستخدام عدد قليل من الأجنة، بدلا من القمامة كاملة.قبل البدء في الإجراء، تأكد أولاً من الحمل بالموجات فوق الصوتية في اليوم الجنيني 10.5 من التزاوج في الوقت المناسب. احصد الأجنة، رش بطن الفأرة الحامل بنسبة 70٪ الإيثانول، واستخدم المقص لفتح تجويف البطن لاستخراج الرحم. اغسل الرحم في طبق بيتري من HBSS الباردة الجليد قبل وضع الجهاز في طبق بيتري الثاني من الجليد الطازج HBSS.تحت نطاق تشريح، وإزالة الأجنة من القرن الرحم والسائل السلوي الفردية، ووضع كل جنين على الجانب السفلي من غطاء لوحة 12 جيدا، على الجليد، كما يتم حصادها. استخدام ورقة مرشح لإزالة أي سائل المحيطة كل جنين، دون لمس الأجنة نفسها، وغمر الأجنة في سائل 4٪ ذوبان أغروز منخفضة. ضع غطاء اللوحة على الجليد لترسيخ الأغاروز.عندما يكون agarose قد تصلب، الوجه على الأجنة وتغطية الجانب الآخر من كل عينة مع agarose إضافية. عندما يتوطد الحجم الثاني من agarose، استخدم المجهر تشريح الفلوريس لتقليم agarose حول كل جنين بحيث سيتم توجيه كل جنين بشكل صحيح على مرحلة هزاز. وينبغي أن تكون نوى oculomotor ومحور عصبي في وقت مبكر من الفلورسنت.محاذاة كل جنين بحيث نواة، محاور متفرعة، والعين تشكل خطا، واستخدام شفرة حلاقة لتقليم agarose موازية لهذا الخط. بعد ذلك ، املأ غرفة الاهتزاز مع عازلة شريحة الجليد الباردة ، و superglue الجنين الأول إلى مرحلة الاهتزاز بحيث يكون النصل موازيًا مع نواة العيون والعيون oculomotor. عندما يكون الغمرة الفائقة جافة، غمر مرحلة الاهتزاز بحيث يتم توجيه الجنين في مواجهة بعيدا عن شفرة، واستخدام شفرة هزلية جديدة للحصول على شرائح 400-450 ميكرومتر.استخدام ماصة نقل العقيمة لنقل كل شريحة في المخزن المؤقت تشريح الباردة كما هو المكتسبة، واستخدام المجهر تشريح الفلوريستين لتحديد شريحة تحتوي على نوى oculomotor والعينين. باستخدام ماصة نقل معقم، نقل شريحة على إدراج ثقافة الخلية في لوحة ستة بئر تحتوي على 1.5 ملليلتر من المتوسط ثقافة في البئر، ووضع لوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. إزالة agarose المتبقية من مرحلة هزاز، وsuperglue الجنين المقبل على خشبة المسرح، والاستمرار في جمع شرائح حتى تم تقسيم جميع الأجنة ومطلية.ثم إضافة التركيز المناسب من المانع أو جزيء المؤتلف من الفائدة، مخففة في المذيب المناسب، إلى الوسط من كل بئر. إنشاء منحنى استجابة الجرعة. صورة الشرائح كل 30 دقيقة على النقيض من المرحلة والمجهر الفلوريسنس لمدة تصل إلى 72 ساعة.خلال فترة التطور الطبيعي في الرحم، تصل أول محاور محورية أوكولوموتوكرية إيجابية بالبروتين الأخضر إلى المدار في اليوم الجنيني 11.5 قبل أن تتفرع إلى أهدافها النهائية، كما لوحظ في ثقافة الشريحة التمثيلية هذه. اتجاه الشريحة على مرحلة الاهتزاز أمر بالغ الأهمية ، حيث أن الشرائح غير قابلة للتفسير إذا لم تكن موجهة بشكل صحيح. على سبيل المثال، إذا كان الجنين يميل إلى جانبه، سيتم ملاحظة نواة واحدة فقط من الoculomotor داخل الشريحة.إذا كان الجنين جزءا لا يتجزأ من إمالة بعيدا جدا نحو ظهره، والعينين لن تكون موجودة داخل شريحة، وبدلا من ذلك قد يتم تضمين الطرف العلوي و hindbrain أو الحبل الشوكي. من المهم أيضا أن تأخذ الرعاية أنه خلال وضع شريحة على غشاء الثقافة، أن الأنسجة لا تصبح مطوية. الحرص عند حل المثبطات وعوامل النمو في المذيبات العضوية.على سبيل المثال، في هذه التجربة، توفي شريحة بعد إضافة الإيثانول إلى الوسط. تذكر أن تبقي كل شيء على الجليد وتقليل الوقت بين استخراج الأجنة ووضع شرائح في الحاضنة. باستخدام هذه التقنية، بدأنا في تحديد آليات إضافية لتوجيه محور عصبي في العمل في نظام المحركات العينية.تذكر أن الحذر عند العمل مع شفرات الحلاقة وأن بعض مثبطات قد تكون خطرة وينبغي التعامل معها بعناية وفقا لمحات السلامة الخاصة بهم.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

عضوي النمط من الثقافة شريحة GFP - معربا عن أجنة الفئران لريال مدريد في الوقت ثمرة تصوير الأعصاب الطرفية

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: نظام وحدات البرمجيات لالمحرك للعين التجريب

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker، نهجا مبتكرا لتحليل الآلي المحرك للعين

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

في الجسم الحي بعد الولادة التثقيب الكهربائي والوقت الفاصل بين التصوير من أرومة عصبية الهجرة في الدماغ الحادة ماوس شرائح

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

في الجسم الحي التصوير من الألياف البصرية النزاهة العصب عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي تعزيز التباين في الفئران

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ<em&gt; في أوتيرو</em&gt; إليكتروبوراتيون

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

إعداد شرائح الشبكية الطازجة من الزرد الكبار السابقين فيفو التصوير تجارب

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

الرحم السابقين انهانسر والثقافات أورجانوتيبيك شريحة من أدمغة الفأر الجنينية للعيش-التصوير لترحيل إينتيرنيورونس جابايرجيك

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...