Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Finansiering fra National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute for Child sundhed and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk videnskabsmand udviklings program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career starter Og børnehospitalet oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE er et Howard Hughes Medical Institute investigator.

Alt dyre arbejde, der er beskrevet her, blev godkendt og udført i overensstemmelse med Boston children's Hospital institutionelle dyrepleje og brug Komité (IACUC) protokoller.
1. tidsindstillede parringer
<ol><li>Placer ISLMN: gfp (Islet motor neuron grøn fluorescerende protein; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock No: 017952) mandlige og hunmus sammen natten over. Vejning af hunnerne og plade Lodderne før parring. Bemæ...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Denne ex vivo Slice-kultur protokol giver betydelige fordele i forhold til traditionelle Axon-vejlednings assays23. Størrelsen af hver kranie motor kerne er ikke en begrænsende faktor, og ingen vanskelig dissektion er nødvendig. Den endogene mikromiljø, hvorigennem axoner rejse vedligeholdes, tillader ændring af en signalering pathway samtidig bevare andre signalering veje. Derudover kan virkningerne vurderes på forskellige punkter langs Axon-forløbet. Da Axon vejledning kræver flere signa...

Det okulære motorsystem giver et elegant system til undersøgelse af Axon-vejlednings mekanismerne. Det er relativt ukompliceret, bestående af tre kranielle nerver endelser seks ekstrokulære muskler (eoms) som bevæger øjet, og levator palpebrae superioris (LPS), som løfter øjenlåget. Den oculomotoriske nerve innervates LPS og fire EOMs-den ringere skrå og den mediale, ringere, og overlegne rectus femoris muskler. De to andre nerver, trochlear og bortførelser, hver eneste inderverer en muskel, den overlegne skrå og laterale rectus femoris muskel, hhv. Øjenbevægelser giver en nem aflæsning, viser, om innervation var passende, manglende eller afvigende. Derudover, der er menneskelige øjenbevægelser lidelser, der skyldes underskud i neuronal udvikling eller Axon vejledning, kollektivt betegnet de medfødte kranielle disinnervation lidelser (CCDDs)1.
På trods af disse fordele anvendes det okulære motorsystem sjældent i Axon-vejlednings studierne2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10på grund af tekniske ulemper. In vitro Axon vejlednings analyser har mange ulemper11. Co-Culture assays, hvor neuronal bruskeksplantater dyrkes sammen med bruskeksplantater af målvæv12 eller transficeret celler13, afhænger af både symmetri af forklarelsen og præcis positionering mellem forklaren og målvæv. Stripe assays14,15, hvor to stikord er fastlagt i vekslende striber og axoner vurderes for præference vækst på en stribe, kun indikerer, at et substrat er at foretrække frem for den anden, ikke at enten er attraktiv eller repulsiv, eller fysiologisk relevant. Microfluidics kamre kan danne præcise kemiske gradienter, men underkastes voksende axoner til at forskyde stress16,17,18, som kan påvirke deres vækst. Desuden kræver indsamling af bruskeksplantater eller dissocierede celler i hver af disse tilgange, at udvoksede axoner skal axotomiseret, og disse undersøgelser undersøger således faktisk Axon-regenerering i stedet for Initial Axon-udvækst. Endelig, disse in vitro tilgange fjerne det mikromiljø, der påvirker axoner og deres svar på signaler langs forskellige punkter i deres kursus, og traditionelt kun teste en cue i isolation. Sammenblanding af disse ulemper, den lille størrelse af hver kerne i det okulære motorsystem gør dissektion teknisk udfordrende for enten bruskeksplantater eller dissocierede kulturer. Desuden primære kulturer af okulære motoriske neuroner er normalt heterogene, har betydelig celledød, og er tæthed afhængige, der kræver pooling af celler fra flere embryoner (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, dog, herunder knockout musemodeller, er upassende at bruge til screening, i betragtning af den tid og udgifter, der kræves.
Metoder udviklet til kultur hele embryoner19 tillade mærkning af migrerende celler20 eller blokade af specifikke molekyler21, men hele embryo kulturer kræver inkubation i rulle flasker, som udelukker real-time billeddannelse af mærkede Strukturer. Kirurgiske teknikker, der tillader manipulation af embryonet og derefter efterfølgende videre udvikling enten i livmoderen eller i maven af moderen (opretholdelse af placenta forbindelsen)22 er også muligt, men disse giver heller ikke tid-lapse Imaging.
For at overvinde hindringerne for in vitro-assays og muliggøre hurtig screening af signalerings veje blev der udviklet en ex vivo-kultur teknik for embryonale skiver23, der er tilpasset fra en tidligere offentliggjort protokol for perifere nerve udvækst24. Ved hjælp af denne protokol, kan udvikle oculomotoriske nerve blive afbildet over tid i nærværelse af mange af de omgivende strukturer langs dens bane, herunder EOM mål. Ved at tilføje små molekyle hæmmere, vækstfaktorer eller vejlednings signaler til kultur medierne kan vi vurdere vejlednings forstyrrelser på flere punkter langs Axon-forløbet, hvilket giver mulighed for en hurtigere vurdering af potentielle vækst-og vejlednings faktorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Nøjagtige øjenbevægelser er afgørende for synet, men udviklingen af det okulære motorsystem, især de molekylære veje, der styrer Axon-vejledningen, er ikke fuldt belyst. Dette skyldes til dels de tekniske begrænsninger i de traditionelle Axon-vejlednings assays. For at identificere yderligere Axon-vejlednings signaler, der påvirker oculomotoriske-nerven, er en ex vivo-skive analyse til at afbilde okulomotor nerven i realtid, da den vokser mod øjet, udviklet. E 10.5 ISLMN-gfp- embryoner bruges til at generere ex vivo-skiver ved at indlejre dem i agopstået, udskæring på en vibratome og derefter dyrke dem i en mikroskop fase-top inkubator med tidsforskudt photomicroskopi for 24-72 h. kontroludsnit rekapitulere den in vivo timing af udvækst af axoner fra kernen til kredsløb. Små molekyle hæmmere eller rekombinante proteiner kan tilsættes til kultur medierne for at vurdere de forskellige Axon-vejlednings forløses rolle. Denne metode har fordelene ved at opretholde mere af det lokale mikromiljø, hvorigennem axoner Traverse, ikke axotomizing de voksende axoner, og vurdere axoner på flere punkter langs deres bane. Den kan også identificere effekter på bestemte undergrupper af axoner. For eksempel, hæmning af CXCR4 forårsager axoner stadig inden for midthjernen til at vokse dorsalt snarere end Ventrally, men axoner, der allerede har forladt ventrally påvirkes ikke.

Normale resultater: figur 1 giver en skematisk af eksperimentet. Begyndende så tidligt som E 9.5 i mus begynder de første axoner at dukke op fra oculomotoriske Nucleus26. Ved E 10.5, en fasciculated oculomotoriske nerve, som indeholder de tidlige Pioneer neuroner, kan ses i mesenchyme. Der er betydelig variation mellem embryoner på E 10.5 (selv inden for samme kuld) i hvor langt nerven er skredet mod kredsløb, sandsynligvis på grund af udviklingsmæssige forskell...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

En ex vivo skive analyse tillader oculomotoriske nerve udvækst at blive afbildet i realtid. Udsnit genereres ved at indlejre E 10.5 ISLMN: gfp -embryoner i agopstået, udskæring på en vibratome og vokser i en scene-top inkubator. Axon-vejlednings forløbene vurderes ved at tilføje inhibitorer til kultur medierne.

Ex vivo oculomotor skive kultur fra embryonale GFP-udtrykker mus for tidsforskudt billeddannelse af oculomotor nerve outgrowth

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Denne protokol giver os mulighed for at identificere axon vejledning veje aktive i oculomotor nerve og til at vurdere deres roller på forskellige punkter langs nerve bane i realtid. Denne teknik bevarer de lokale miljøer, hvorigennem axoner rejser og deres endelige mål. De voksende axoner skæres ikke, så indledende axon udvækst, snarere end regenerering, kan vurderes.Denne metode giver indsigt i axon vejledning i det okulære motorsystem, men kunne tilpasses til studiet af axon vejledning af andre nerver. Denne teknik tager praksis at mestre, og arbejder hurtigt er yderst vigtigt. Når du prøver det for første gang, bruge blot et par embryoner, snarere end et helt kuld.Før du begynder proceduren, først bekræfte graviditeten ved ultralyd på embryonale dag 10,5 fra en tidsdisk parring. Høst embryoner, spray maven af den gravide mus med 70% ethanol, og bruge en saks til at åbne bughulen til at udtrække livmoderen. Vask livmoderen i en petriskål af iskold HBSS, før du placerer orgelet i en anden petriskål med frisk iskold HBSS.Under dissekering omfang, fjerne embryoner fra livmoderen horn og deres individuelle fostervandssække, placere hvert foster på undersiden af låget af en 12-brønd plade, på is, som de er høstet. Brug filterpapir til at fjerne væsker omkring hvert foster, uden at røre embryonerne selv, og nedsænkning embryonerne i flydende 4% lavsmeltende agarose. Læg pladelåget på is for at størkne agarose.Når agarose er hærdet, flip over embryoner og dække den anden side af hver prøve med yderligere agarose. Når det andet bind af agarose er størknet, skal du bruge et fluorescensdekermikroskop til at trimme agarose omkring hvert foster, så hvert foster vil blive orienteret korrekt på vibratomestadiet. Den oculomotor kerner og tidlige axon udvækster bør fluorescerende.Juster hvert foster, så kernen, outgrowing axoner, og øjet danner en linje, og bruge et barberblad til at trimme agarose parallelt med denne linje. Dernæst fylde vibratome kammer med iskold skive buffer, og superlim det første foster til vibratome fase, således at bladet vil være parallel med oculomotor kernen og øjne. Når superlimen er tør, nedsænkes vibratomstadiet, så fosteret vender mod væk fra klingen, og brug en ny vibratomkling for at opnå 400-til 450-mikrometerskiver.Brug en steril overførselpipette til at overføre hver skive til kold udskæringsbuffer, som den er anskaffet, og brug fluorescensdekermikroskopet til at vælge den skive, der indeholder oculomotorkerner og øjne. Ved hjælp af en steril overførselpipette, overføre skiven på en cellekultur indsætte i en seks-brønd plade, der indeholder 1,5 milliliter kultur medium per brønd, og placere pladen i en 37-graders Celsius inkubator. Fjern den resterende agarose fra vibratome fase, og superlim det næste foster på scenen, fortsætter med at indsamle skiver, indtil alle embryoner er blevet opdelt og belagt.Derefter tilsættes den passende koncentration af inhibitor eller rekombinant molekyle af interesse, fortyndet i et passende opløsningsmiddel, til medium for hver brønd. Opret en dosis-respons kurve. Billede skiverne hver 30 minutter efter fase kontrast og fluorescens mikroskopi i op til 72 timer.Under normal i livmoderudvikling, den første grønne fluorescerende protein-positive oculomotor axoner nå kredsløbet ved embryonale dag 11,5 før forgrening til deres endelige mål, som observeret i denne repræsentative skive kultur. Skivens retning på vibratomestadiet er afgørende, da skiverne ikke kan fortolkes, hvis de ikke er orienteret korrekt. For eksempel, hvis fosteret vippes til sin side, vil kun én oculomotor kerne blive observeret i skiven.Hvis det indlejrede foster vippes for langt mod ryggen, vil øjnene ikke være til stede i skiven, og i stedet kan overlestremnet og baghjernen eller rygmarven medtages. Det er også vigtigt at passe på, at under placeringen af skiven på kulturmembranen, at vævet ikke bliver foldet. Vær forsigtig, når du opløser hæmmere og vækstfaktorer i organiske opløsningsmidler.For eksempel, i dette eksperiment, skiven døde efter tilsætning af ethanol til mediet. Husk at holde alt på is og minimere tiden mellem udvinding af embryoner og placere skiver i rugemaskinen. Ved hjælp af denne teknik er vi begyndt at identificere yderligere axonstyringsmekanismer på arbejdspladsen i det okulære motorsystem.Husk at udvise forsigtighed, når du arbejder med barberblade, og at nogle inhibitorer kan være farlige og skal håndteres omhyggeligt i henhold til deres sikkerhedsprofiler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: En modulær softwaresystem til øjenmotorik Eksperimenter

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging af gliacelle Behaviors Live zebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Fødselsdepression Elektroporation og Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Mouse Akut hjerneskiver

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo billeddannelse af Optic Nerve Fiber Integritet ved kontrast-forstærket MRI i mus

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skive kultur af embryonale mus hjernen ved hjælp af<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forbereder frisk Retinal skiver fra voksen zebrafisk for Ex Vivo billeddannelse eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Elektroporation og Organotypic skive kulturer af embryonale mus hjerner for Live-Imaging af migrerer GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...