Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Financiering door het National Eye Institute [5K08EY027850], Nationaal Instituut voor kindgezondheid en ontwikkeling [U54HD090255], Harvard-Vision Development Program [5K12EY016335], de Knights Templar Eye Foundation [carrière starter Grant], en de Children's Hospital Ophthalmologie Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

Alle hier beschreven dier werkzaamheden zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de protocollen van het Boston Children's Hospital institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC).
1. getimede paringen
<ol><li>Plaats ISLMN: GFP (eilandje motor neuron groen fluorescerende eiwitten; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock No: 017952) mannelijke en vrouwelijke muizen 's nachts samen. Weeg de vrouwtjes en het record ...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Dit ex vivo segment cultuur protocol biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele axon guidance-testen23. De grootte van elke craniale motor kern is geen beperkende factor, en geen moeilijke dissectie is noodzakelijk. De endogene micro omgeving waardoor de axonen reizen wordt gehandhaafd, waardoor wijziging van een signalering traject met behoud van andere signalering trajecten. Bovendien kunnen effecten worden beoordeeld op verschillende punten langs het axon-traject. Aangezien a...

Het oculair motorsysteem biedt een elegant systeem voor het onderzoeken van Axon geleidings mechanismen. Het is relatief ongecompliceerd, bestaande uit drie craniale zenuwen innervating zes extraocular spieren (EOMs) die het oog bewegen, en de levator palpebrae superioris (LPS) die het ooglid liften. De Oculomotor zenuw innert de lp's en vier eoms-de minderwaardige schuine en de mediale, inferieure en superieure rectus spieren. De andere twee zenuwen, de trochlear en kidnens, elk slechts innervate één spier, de superieure schuine en laterale rectus spier, respectievelijk. Oogbewegingen zorgen voor een gemakkelijke uitlezen, wat aangeeft of innervatie gepast, vermist of afwijkend is. Bovendien, er zijn menselijke oog bewegingsstoornissen die voortvloeien uit tekorten in neuronale ontwikkeling of Axon begeleiding, gezamenlijk aangeduid als de aangeboren craniale desinnervatie stoornissen (Cdd's)1.
Ondanks deze voordelen wordt het oculair motorsysteem zelden gebruikt in axon guidance studies2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, vanwege technische nadelen. In vitro axon begeleiding assays hebben vele nadelen11. Co-cultuur assays, waarin neuronale explanten worden gekweekt samen met explantaten van doelweefsel12 of getranssinfecteerde cellen13, afhankelijk van beide symmetrie van de explant en precieze positionering tussen de explant en het doelweefsel. Stripe assays14,15, waarin twee signalen zijn vastgelegd in afwisselende strepen en axonen worden beoordeeld op preferentiële groei op één streep, geven alleen aan dat één substraat beter is dan de andere, niet dat het aantrekkelijk is of weerzinwekkend, of fysiologisch relevant. Microfluïdica kamers kunnen precieze chemische gradiënten vormen, maar het onderwerp groeit axonen om stress16,17,18te afschuiven, wat hun groei kan beïnvloeden. Bovendien, in elk van deze benaderingen, het verzamelen van explanten of gezien cellen vereist dat de uitgroeiende axonen worden axotomized en dus deze tests onderzoeken axon regeneratie, in plaats van initiële axon uitgroei. Tot slot, deze in vitro benaderingen verwijderen van de micro-omgeving die invloed op axonen en hun reacties op hints langs verschillende punten van hun cursus, en traditioneel slechts één hint in isolatie te testen. Door deze nadelen te comperen, maakt de geringe omvang van elke Nucleus in het oculaire motorsysteem de dissectie technisch uitdagend voor zowel explantaten als gedisiteerde culturen. Bovendien zijn primaire culturen van oculaire motorneuronen meestal heterogeen, hebben significante celdood, en zijn dichtheids afhankelijke, waarbij het groeperen van cellen uit meerdere embryo's vereist is (Ryosuki Fujiki, persoonlijke communicatie). In vivo methoden, met inbegrip van Knockout muismodellen, zijn echter ongeschikt om te gebruiken voor screening, gezien de tijd en kosten die nodig zijn.
Methoden die zijn ontwikkeld voor het kweken van hele embryo's19 het labelen van cellen20 of blokkade van specifieke moleculen21toestaan, maar hele embryo culturen vereisen incubatie in roller flessen die real-time beeldvorming van gelabelde Structuren. Chirurgische technieken die manipulatie van het embryo mogelijk maken en vervolgens verdere ontwikkeling in de baarmoeder of in de buik van de moeder (het handhaven van de placentaire verbinding)22 kunnen ook worden uitgevoerd, maar deze laten ook geen time-lapse Imaging.
Om de obstakels van in vitro testen te overwinnen en een snelle screening van signalerings trajecten mogelijk te maken, werd een ex vivo embryonale segment kweek techniek ontwikkeld23, aangepast van een eerder gepubliceerd protocol voor perifere zenuw groei24. Met behulp van dit protocol, de ontwikkelende Oculomotor zenuw kan worden afgebeeld in de tijd in de aanwezigheid van veel van de omringende structuren langs haar traject, met inbegrip van EOM targets. Door kleine molecuul remmers, groeifactoren of geleidings signalen aan de cultuur media toe te voegen, kunnen we geleidings verstoringen op meerdere punten langs het axon-traject beoordelen, waardoor een snellere beoordeling van potentiële groei-en geleidings factoren mogelijk is.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Nauwkeurige oogbewegingen zijn cruciaal voor het gezichtsvermogen, maar de ontwikkeling van het oculair motorsysteem, met name de moleculaire trajecten die de axon-geleiding beheersen, is niet volledig opgehelderd. Dit is deels te wijten aan technische beperkingen van traditionele axon guidance testen. Om aanvullende axon geleidings signalen te identificeren die de Oculomotor zenuw beïnvloeden, een ex vivo slice assay om de Oculomotor zenuw in real-time te afbeelden naarmate deze in de richting van het oog groeit, werd ontwikkeld. E 10.5 ISLMN-GFP- embryo's worden gebruikt om ex vivo-segmenten te genereren door ze in agarose in te sluiten, te snijden op een vibratome en ze vervolgens te kweken in een Microscoop-topincubator met timelapse-photomicroscopie voor 24-72 h. regel segmenten even de in vivo timing van de uitgroei van axonen van de Nucleus naar de baan. Kleine molecuul remmers of recombinant proteïnen kunnen aan de kweekmedia worden toegevoegd om de rol van verschillende axon geleidings trajecten te beoordelen. Deze methode heeft de voordelen van het handhaven van meer van de lokale micro omgeving waardoor axonen doorkruisen, niet axotomiseren van de groeiende axonen, en het beoordelen van de axonen op meerdere punten langs hun traject. Het kan ook effecten op specifieke subsets van axonen identificeren. Bijvoorbeeld, remming van CXCR4 zorgt ervoor dat axonen nog steeds binnen de middenhersenen groeien schrapen in plaats van ventraal, maar axonen die al hebben verlaten ventraal zijn niet aangetast.

Normale resultaten: Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van het experiment. Beginnend met E 9.5 in muis, beginnen de eerste axonen uit de Oculomotor Nucleus26te ontstaan. Door E 10.5, een fascicgeënt Oculomotor zenuw, die de vroege Pioneer neuronen bevat, kan worden gezien in de Mesenchyme. Er is een significante variabiliteit tussen embryo's op E 10.5 (zelfs binnen hetzelfde nest) in hoever de zenuw is gevorderd naar de baan, waarschijnlijk als gevolg van o...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Dit protocol stelt ons in staat om axon begeleidingstrajecten actief in de oculomotorische zenuw te identificeren en om hun rollen te beoordelen op verschillende punten langs het zenuwtraject in real time. Deze techniek behoudt de lokale omgevingen waardoor axonen reizen en hun uiteindelijke doelen. De groeiende axonen worden niet gesneden, dus initiële axon uitgroei, in plaats van regeneratie, kan worden beoordeeld.Deze methode geeft inzicht in axon begeleiding in het oculaire motorsysteem, maar kan worden aangepast aan de studie van axon begeleiding van andere zenuwen. Deze techniek neemt de praktijk onder de knie, en snel werken is uiterst belangrijk. Wanneer u het voor de eerste keer probeert, gebruik dan slechts een paar embryo's, in plaats van een heel nest.Voordat u met de procedure begint, bevestigt u eerst de zwangerschap door echografie op embryonale dag 10,5 van een getimede paring. Oogst de embryo's, spray de buik van de zwangere muis met 70%ethanol en gebruik een schaar om de buikholte te openen om de baarmoeder te extraheren. Was de baarmoeder in een petrischaaltje ijskoud HBSS voordat u het orgel plaatst in een tweede petrischaaltje van verse ijskoude HBSS.Verwijder onder een ontledend toepassingsgebied de embryo's uit de baarmoederhoorn en hun individuele vruchtzakjes en plaats elk embryo op de onderkant van het deksel van een 12-bronplaat, op ijs, terwijl ze worden geoogst. Gebruik filterpapier om elke vloeistof rond elk embryo te verwijderen, zonder de embryo's zelf aan te raken, en dompel de embryo's onder in vloeibare 4%laag smeltende agarose. Plaats het plaatdeksel op ijs om de agarose te stollen.Wanneer de agarose is uitgehard, draai dan de embryo's om en bedek de andere kant van elk monster met extra agarose. Wanneer het tweede volume van agarose is gestold, gebruik dan een fluorescentie ontleden microscoop om de agarose trim rond elk embryo, zodat elk embryo goed zal worden georiënteerd op het vibratome stadium. De oculomotorische kernen en vroege axon uitwassen moeten fluorescerend zijn.Lijn elk embryo zo uit dat de kern, ontgroeiende axonen en oogvorm een lijn vormen, en gebruik een scheermesje om de agarose parallel aan deze lijn te trimmen. Vul vervolgens de vibratomekamer met ijskoude plakbuffer en verlijm het eerste embryo naar het vibratome stadium, zodat het blad parallel loopt met de oculomotorische kern en ogen. Wanneer de superlijm droog is, dompelt u het vibratome-stadium onder, zodat het embryo is gericht op afstand van het blad, en gebruik een nieuw vibratomeblad om plakjes van 400 tot 450 micrometer te verkrijgen.Gebruik een steriele overdracht pipet om elk plakje over te brengen in koude snijden buffer als het wordt verworven, en gebruik de fluorescentie ontleden microscoop om het segment met de oculomotorische kernen en ogen te selecteren. Met behulp van een steriele overdracht pipet, breng het segment op een cel cultuur invoegen in een zes-put plaat met 1,5 milliliter cultuur medium per put, en plaats de plaat in een 37-graden Celsius incubator. Verwijder de resterende agarose uit het vibratome stadium, en superlijm het volgende embryo op het podium, blijven plakken verzamelen totdat alle embryo's zijn geneuder en verguld.Voeg vervolgens de juiste concentratie van de remmer of recombinant molecuul van belang, verdund in een geschikt oplosmiddel, toe aan het medium van elke put. Maak een dosisresponscurve. Beeld de plakjes om de 30 minuten door fasecontrast en fluorescentiemicroscopie voor maximaal 72 uur.Tijdens de normale ontwikkeling van de utero bereiken de eerste groene fluorescerende eiwitpositieve oculomotorische axonen de baan per embryonale dag 11,5 voordat ze vertakken tot hun uiteindelijke doelen, zoals waargenomen in deze representatieve slicecultuur. De oriëntatie van het segment op de vibratome fase is van cruciaal belang, omdat de segmenten niet interpreteerbaar zijn als ze niet goed zijn georiënteerd. Als het embryo bijvoorbeeld naar zijn kant wordt gekanteld, wordt er slechts één oculomotorische kern waargenomen in het segment.Als het ingebedde embryo te ver naar zijn rug wordt gekanteld, zullen de ogen niet aanwezig zijn in de slice, en in plaats daarvan kunnen de bovenste ledematen en achterheren of het ruggenmerg worden opgenomen. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat tijdens de plaatsing van het plakje op het cultuurmembraan, dat het weefsel niet wordt gevouwen. Let op bij het oplossen van de remmers en groeifactoren in organische oplosmiddelen.Bijvoorbeeld, in dit experiment, de slice stierf na de toevoeging van ethanol aan het medium. Vergeet niet om alles op ijs te houden en de tijd tussen de extractie van de embryo's en het plaatsen van de plakjes in de couveuse te minimaliseren. Met behulp van deze techniek zijn we begonnen met het identificeren van extra axon geleidingsmechanismen op het werk in het oculaire motorsysteem.Vergeet niet voorzichtig te zijn bij het werken met scheermesjes en dat sommige remmers gevaarlijk kunnen zijn en zorgvuldig moeten worden behandeld volgens hun veiligheidsprofielen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo&#39;s voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: Een modulair software systeem voor oogmotorische Experimenteren

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, een innovatieve geautomatiseerde benadering van oculomotorische Analyse

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve doorsnijding en Time-lapse beeldvorming van gliacellen Gedrag Live zebravis

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo beeldvorming van Optic Nerve Fiber Integrity by-Contrast Enhanced MRI in Muizen

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging van Migreren Neuronen in Organotypische Slice Cultuur van Embryonale Muishersenen Met behulp van<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Voorbereiding verse retinale segmenten van volwassen Zebrafish voor Ex Vivo Imaging experimenten

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...