Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

מימון שסופקו על ידי מכון העין הלאומי [5K08EY027850], המכון הלאומי של בריאות הילד ופיתוח [U54HD090255], הרווארד-חזון המחקר הקליני תוכנית פיתוח [5K08EY027850], האבירים הטמפלרים עין הקרן [קריירה המתחיל גרנט], בית החולים לרפואת עיניים וקרן הילדים [פרס דיסקברי הפקולטה]. . הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז

כל העבודה בעלי חיים תיאר כאן אושרה והתבצע בציות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים והוועדה לשימוש (IACUC) פרוטוקולים.
1. מועד מתוזמן
<ol><li>מקום איי. איי. אן : gfp (מוטוריים איון תא העצב חלבון פלורסנט ירוק; MGI: J:132726; ג'אקס Tg (איי-באקס) 1Slp/J מלאי: 017952</strong...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

זה הפרוטוקול הvivo לשעבר התרבות הפרוסה מספק יתרונות משמעותיים על הנחיית האקסון המסורתית שאומר23. הגודל של כל גרעין המנוע הגולגולתית אינו גורם מגביל, ואין צורך בניתוח קשה. הסביבה האנדודוגני שדרכה לנסוע אקסונים מתוחזק, מתן אפשרות לשינוי של מסלול איתות אחד תוך שמירה על מסלולים אית...

מערכת מנוע עינית מספקת מערכת אלגנטית לחקירת מנגנוני הדרכה אקסון. זה מסובך יחסית, המורכב של שלוש עצבי הגולגולת innervating six שרירי העין (eoms) אשר להזיז את העיניים, ואת השריר palpebrae סופרוריס (lps) אשר מרים את העפעף. העצב מניע העיניים innervates LPS וארבעה EOMs-האלכסוני הנחות האמצעי, נחותים, והשרירים rectus מעולה. שני העצבים האחרים, הטרוליר והחוטפים, כל אחד מinnervate רק שריר אחד, השריר האלכסוני והשרירי הצדדי העליון, בהתאמה. תנועות עיניים לספק בדיקה קלה, מראה אם אינבציה היה מתאים, חסר או חריג. בנוסף, קיימות הפרעות בתנועת העין האנושית הנובעות מהליקויים בהתפתחות העצבית או הנחיית האקסון, כינה באופן קולקטיבי את הפרעות הגולגולת הולדות (CCDDs)1.
למרות יתרונות אלה, מערכת מנוע עינית משמש לעתים נדירות ב אקסון לימודי הדרכה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , 10, עקב החסרונות הטכניים. באמצעות מבחנה מחוץ לספר ההדרכה יש חסרונות רבים11. שיתוף תרבות שותף, שבו האקסופלאליות מתורבת הם מתורבתים יחד עם explants של רקמת היעד12 או תאים מזוהמים13, תלוי הן בסימטריה של מיקום מדויק והמדויק בין רקמת המטרה. פס מספר14,15, שבו שני רמזים מונחים בפסים ואקטונים מתחלפים מוערך על גידול מועדף על פס אחד, רק לציין כי מצע אחד עדיף על השני, לא כי או הוא אטרקטיבי או דוחה, או רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מיקרופלואידיקה צ'יימברס יכול ליצור מעברי צבע כימיים מדויקים, אבל כפופים הגדלים אקסונים כדי להטות את הלחץ16,17,18, אשר יכול להשפיע על התפתחותם. יתר על כן, בכל הגישות הללו, איסוף האקסוצמחים או תאים הנתק דורש כי אקסונים הגוברת להיות axotom, ולכן אלה בחני למעשה לבחון התחדשות אקסונים, במקום אקסונים הראשונית הצמיחה. לבסוף, בגישות החוץ-גופית מסירים את המיקרו-סביבה המשפיעה על האקסון ועל תגובותיהם לרמזים לאורך נקודות שונות, ובאופן מסורתי בודקים רק אות אחת בבידוד. הרכבה חסרונות אלה, הגודל הקטן של כל גרעין במערכת המנוע העינית מאפשר לקרע מאתגרת מבחינה טכנית עבור הרחבות או תרבויות הנתק. בנוסף, התרבויות הראשיות של נוירונים מוטוריים העינית הם בדרך כלל הטרוגנית, יש מוות תאים משמעותיים, והם תלויים צפיפות, המחייב אגירת תאים מעוברים מרובים (Ryosuki פוג'יקי, תקשורת אישית). עם זאת, בשיטות vivo, לרבות מודלים של עכבר מהממת, אינם מתאימים לשימוש בהקרנה, בהתחשב בזמן ובהוצאות הנדרשות.
שיטות שפותחו לתרבות העוברים שלמים19 לאפשר תיוג של תאים הגירה20 או מצור של מולקולות ספציפיות21, אבל תרבויות העובר השלם דורשים דגירה בבקבוקי רולר אשר מונע הדמיה בזמן אמת של תוויות מבנים. טכניקות כירורגיות המאפשרות מניפולציה של העובר ולאחר מכן לאחר מכן פיתוח נוסף ברחם או בבטן של האם (שמירה על חיבור הסביבה)22 הם גם אפשריים, אבל אלה גם לא לאפשר הזמן לשגות דמיה.
כדי להתגבר על המכשולים של מחוץ לבית הספר ולאפשר הקרנה מהירה של מסלולים איתות, הטכניקה vivo לשעבר התרבות פרוסה מתחלקים התפתחה23, המותאם מתוך פרוטוקול שפורסם בעבר היקפית היקפיים מוצלח24. באמצעות פרוטוקול זה, את העצב המתפתח מתפתח לאורך זמן בנוכחות רבים של המבנים שמסביב לעבר מסלול, כולל מטרות EOM. על ידי הוספת מעכבי מולקולה קטנה, גורמי גדילה, או רמזים הדרכה לתקשורת התרבות, אנחנו יכולים להעריך הדרכה רטבאליות בנקודות מרובות לאורך מסלול אקסון, המאפשר הערכה מהירה יותר של גורמי צמיחה פוטנציאליים הדרכה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

תנועות עיניים מדויקות הם חיוניים לחזון, אבל הפיתוח של מערכת מנוע עינית, במיוחד מסלולים מולקולריים השליטה אקסון הדרכה, לא הובהר במלואו. הדבר נובע בחלקו ממגבלות טכניות של הנחיות האקסון המסורתיות. כדי לזהות רמזים נוספים הנחיות הדרכה המשפיעים על העצב מניע העיניים, vivo slice לשעבר התמונה לדמות את העצב מניע העיניים בזמן אמת כפי שהוא גדל לקראת העין פותחה. E 10.5 אי אן איי -gfp העוברים משמשים להפקת פרוסות vivo לשעבר על ידי הטבעת אותם בתוך agarose, פרוסות על הרטט, ולאחר מכן גדל אותם בשלב מיקרוסקופ העליון החממה עם הזמן לשגות photomicroscopy עבור 24-72 h. שליטה פרוסות לכידה בעיתוי vivo של צמיחה של אקסונים מן הגרעין אל המסלול. מולקולות קטנות מעכבי או חלבונים רקומביננטי ניתן להוסיף לתקשורת התרבות כדי להעריך את התפקיד של מסלולים הדרכה שונים אקסון. שיטה זו מקבלת את היתרונות של שמירה על יותר של המיקרו-סביבה המקומית שדרכה עוברים האקסונים, לא axotom, ומעריכים את האקסונים בנקודות מרובות לאורך מסלול שלהם. הוא יכול גם לזהות אפקטים בערכות ממשנה ספציפיות של axons. לדוגמה, עיכוב של CXCR4 גורם אקסונים עדיין בתוך המוח האמצע כדי לגדול dorsally ולא ventrally, אבל אקסונים כי כבר יצא ventrally לא מושפעים.

תוצאות נורמליות: איור 1 מספק תרשים שרטוט של הניסוי. החל מוקדם ככל E 9.5 בעכבר, האקטונים הראשונים מתחילים לצאת מן הגרעין עושות26. על ידי E 10.5, העצב מניע העיניים, אשר מכיל את הנוירונים חלוץ מוקדם, ניתן לראות את mesenchyme. יש שונות משמעותית בין עוברים ב-E 10.5 (אפילו בתוך אותה ה...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לזהות מסלולי הנחיית אקסון הפעילים בעצב oculomotor ולהעריך את תפקידם בנקודות שונות לאורך מסלול העצבים בזמן אמת. טכניקה זו משמרת את הסביבות המקומיות שדרך אקסונים נוסעים ואת המטרות הסופיות שלהם. האקסונים הגדלים אינם נחתכים, ולכן ניתן להעריך את גידול האקסון הראשוני, ולא את ההתחדשות.שיטה זו מספקת תובנות על הדרכה אקסון במערכת המנוע העין אבל יכול להיות מותאם לחקר הדרכה אקסון של עצבים אחרים. טכניקה זו דורשת תרגול כדי לשלוט, ולעבוד במהירות היא חשובה ביותר. כאשר מנסים את זה בפעם הראשונה, להשתמש רק כמה עוברים, ולא המלטה שלמה.לפני תחילת ההליך, ראשית לאשר את ההריון על ידי אולטרסאונד ביום עוברי 10.5 מהזדווגות מתוזמן. לקצור את העוברים, לרסס את הבטן של העכבר בהריון עם 70% אתנול, ולהשתמש מספריים כדי לפתוח את חלל הבטן כדי לחלץ את הרחם. לשטוף את הרחם בצלחת פטרי של HBSS קר כקרח לפני הנחת האיבר בצלחת פטרי שנייה של HBSS קר כקרח טרי.תחת היקף ניתוח, להסיר את העוברים מן קרן הרחם ושיקי מי האמון האישיים שלהם, הצבת כל עובר על החלק התחתון של המכסה של צלחת 12 באר, על קרח, כפי שהם שנקטפו. השתמש בנייר סינון כדי להסיר כל נוזל המקיף כל עובר, מבלי לגעת בעוברים עצמם, ולהטביע את העוברים ב- agarose נוזלי 4% נמס נמוך. מניחים את מכסה הצלחת על הקרח כדי לחזק את ההתעוררות.כאשר agarose התקשה, להפוך את העוברים לכסות את הצד השני של כל מדגם עם אגרוז נוסף. כאשר הנפח השני של אגרוז התגבש, השתמש במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי כדי לקצץ את ההתעוררות סביב כל עובר, כך שכל עובר יהיה מכוון כראוי על שלב הרטט. הגרעינים oculomotor ו חקלאות אקסון מוקדם צריך להיות פלואורסצנטי.יישר כל עובר כך שהגרעין, האקסונים הצומחים והעין יוצרים קו, ולהשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את ההתעוררות המקבילה לקו זה. לאחר מכן, מלאו את תא הרטט במאגר פרוסות קר כקרח, והדביקו את העובר הראשון לשלב הרטט כך שהלהב יהיה מקביל לגרעין ולעיניים של oculomotor. כאשר דבק העל יבש, הטביעו את שלב הרטט כך שהעובר יהיה מכוון הרחק מהלהב, ולהשתמש בלהב רטט חדש כדי להשיג פרוסות 400 עד 450 מיקרומטר.השתמש פיפטה העברה סטרילית להעביר כל פרוסה לתוך חיץ חיתוך קר כפי שהוא נרכש, ולהשתמש במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי כדי לבחור את הפרוסה המכילה את הגרעינים oculomotor ועיניים. בעזרת פיפטה להעברה סטרילית, מעבירים את הפרוסה לתרבות תאים בצלחת בת שש בארות המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבותי ל הבאר, ומכניסים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס. מוציאים את השאריות מהשלב הויברטום, ומדביקים את העובר הבא על הבמה, וממשיכים לאסוף פרוסות עד שכל העוברים נחתכו וצפו.לאחר מכן מוסיפים את הריכוז המתאים של מעכב או מולקולה רקומביננטי של עניין, מדולל ממס מתאים, למדיום של כל באר. צור עקומת תגובת מינון. תדמיין את הפרוסות כל 30 דקות לפי ניגודיות פאזה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית למשך עד 72 שעות.במהלך נורמלי בהתפתחות ברחם, האקסונים החדשים הראשונים של חלבון פלואורסצנטי חיובי oculomotor להגיע למסלול על ידי יום עוברי 11.5 לפני הסתעפות ליעדים הסופיים שלהם, כפי שנצפה בתרבות פרוסה מייצגת זו. כיוון הפרוסה בשלב הרטט הוא קריטי, כיוון שהפרוסות אינן ניתנות לפרשנות אם הן אינן מכוונות כראוי. לדוגמה, אם העובר מוטה לצדו, רק גרעין oculomotor אחד יצפה בתוך הפרוסה.אם העובר המוטבע מוטה רחוק מדי לכיוון גבו, העיניים לא יהיו קיימות בתוך הפרוסה, ובמקום זאת ניתן לכלול את הגפיים העליונות ואת ההידברות או חוט השדרה. חשוב גם לדאוג כי במהלך המיקום של הפרוסה על קרום התרבות, כי הרקמה לא להיות מקופל. יש לדאוג בעת המסת המעכבים וגורמי גדילה ממיסים אורגניים.לדוגמה, בניסוי זה, הפרוסה מתה לאחר הוספת אתנול למדיום. זכור לשמור הכל על הקרח כדי למזער את הזמן בין החילוץ של העוברים והנחת הפרוסות באינקובטור. באמצעות טכניקה זו, התחלנו לזהות מנגנוני הנחיה אקסון נוספים בעבודה במערכת המנוע העין.זכור לנקוט זהירות בעת עבודה עם סכיני גילוח, כי מעכבים מסוימים עלולים להיות מסוכנים ויש לטפל בזהירות על פי פרופילי הבטיחות שלהם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: מערכת המודולרית תוכנה לoculomotor ניסויים

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, גישה אוטומטית חדשנית לניתוח oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

בהדמית vivo של יושרה סיבי עצב הראייה על ידי contrast-enhanced MRI בעכברים

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...