Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

国立眼科研究所[5K08EY027850]、国立小児保健開発研究所[U54HD090255]、ハーバードビジョン臨床科学者開発プログラム[5K12EY016335]、ナイツテンプラーアイ財団[キャリアスターター]グラント」と小児病院眼科財団[教員発見賞]。ECEはハワード・ヒューズ医学研究所の調査員です。

ここに記載されているすべての動物の仕事は、ボストン小児病院機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)プロトコルに従って承認され、実行されました。
1. 時当て交配
<ol><li>場所ISLMN:GFP (イズレット運動ニューロン緑蛍光タンパク質;MGI: J:132726;Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J ストック No: 017952オスとメスのマウスを一晩一緒に.雌の体重を計量し、...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

このex vivoスライス培養プロトコルは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイ23に対して大きな利点を提供します。各頭蓋運動核の大きさは制限因子ではなく、困難な解剖は必要ありません。軸が移動する内因性微小環境は維持され、他のシグナル伝達経路を維持しながら1つのシグナル伝達経路の修正を可能にする。さらに、効果は軸ゴン軌道に沿って異なるポイントで評価する...

眼モーターシステムは軸の指導メカニズムを調査するための優雅なシステムを提供する。眼を動かす6つの眼外筋肉(EOEM)を抑える3つの頭蓋神経と、まぶたを持ち上げるレベーター・パルペブラー・エクセピアス(LPS)からなる、比較的単純である。オキュロモーター神経は、LPSと4つのEOEMを刺激する - 劣った斜めと中間、劣った、および優れた直腸筋。他の2つの神経は、トロクレアとアブデューセン、それぞれ1つの筋肉、優れた斜めおよび横直腸筋をそれぞれインビナートする。目の動きは、内向きが適切であるか、欠落しているか、または異常であるかどうかを示す、容易な読み出しを提供します。さらに、神経発達または軸次指導の欠損に起因するヒト眼球運動障害があり、総称して先天性頭蓋骨減少障害(CCDDs)1と呼ぶ。
これらの利点にもかかわらず、眼モーターシステムは、アクソンガイダンス研究2、3、4、5、6、7、8でほとんど使用されない9,10、技術的な欠点のため。インビトロ軸ゴンガイダンスアッセイは、多くの欠点を有する 11.共培養アッセイは、ニューロン移植が標的組織12またはトランスフェクト細胞13の移植と共に培養されるもので、移植の対称性と移植組織と標的組織との間の正確な位置決めの両方に依存する。ストライプアッセイ14、15、交互のストライプに2つのキューが置かれ、軸が1つのストライプ上で優遇成長のために評価されるが、一方の基板が他方よりも好ましいことを示すだけで、どちらかが魅力的であるわけではないまたは反発的、または生理学的に関連する。マイクロ流体室は、正確な化学勾配を形成することができますが、被験者は、その成長に影響を与えることができる応力16、17、18をせん断する軸を成長させる。さらに、これらのアプローチのそれぞれにおいて、移植または解離細胞を採取するには、生育軸子が軸化され、したがって、これらのアッセイは、初期軸子の増殖ではなく、実際に軸の再生を調べる必要があります。最後に、これらのインビトロアプローチは、軸が軸に影響を与える微小環境を除去し、そのコースの異なるポイントに沿って手がかりに対する応答を除去し、従来は1つのキューを単独でテストするだけです。これらの欠点を複合化すると、眼モータシステム内の各核のサイズが小さいため、移植または解離培養物の解剖は技術的に困難になります。さらに、眼運動ニューロンの一次培養は、通常、不均一であり、有意な細胞死を有し、密度依存性であり、複数の胚からの細胞のプールを必要とする(藤木良樹、個人的なコミュニケーション)。しかし、ノックアウトマウスモデルを含む生体内法では、必要な時間と費用を考えると、スクリーニングに使用することは不適切です。
胚全体を培養するために開発された方法19は、移動細胞20または特定の分子の遮断の標識を可能にするが、胚培養全体は、標識のリアルタイムイメージングを妨げるローラーボトル内のインキュベーションを必要とする構造。胚の操作を可能にし、その後、子宮または母親の腹部のいずれかのさらなる発達を可能にする外科的技術(胎盤接続を維持する)22も可能であるが、これらはまた、時間経過を可能にしないイメージング。
インビトロアッセイの障害を克服し、シグナル伝達経路の迅速なスクリーニングを可能にするために、exvivo胚スライス培養技術が23を開発し、末梢神経の成長24に関する以前に公表されたプロトコルから適応した。このプロトコルを使用して、発達するオキュロモーター神経は、EOMターゲットを含む軌道に沿った周囲の構造の多くが存在する場合に、時間の経過とともに画像化することができる。培養培地に低分子阻害剤、成長因子、またはガイダンス手がかりを加えることで、軸ゾン軌道に沿った複数の点でガイダンス摂動を評価し、潜在的な成長因子とガイダンス因子をより迅速に評価することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

正確な眼の動きは視力にとって重要であるが、眼運動システム、特に軸ゴンガイダンスを制御する分子経路の開発は完全には解明されていない。これは、従来の軸ゾンガイダンスアッセイの技術的な制限が原因の一部です。眼球運動神経に影響を与える追加の軸方向ガイダンスキューを同定するために、眼に向かって成長するにつれてリアルタイムで眼球運動神経を画像化するex vivoスライスアッセイが開発された。E10.5 IslMN-GFP胚は、アガロースに埋め込み、ビブラートにスライスし、24-72 hのタイムラプスフォト顕微鏡でそれらを成長させることによって、ex vivoスライスを生成するために使用されます。核から軌道への軸索の成長の生体内のタイミング。低分子阻害剤または組換えタンパク質を培養培養培養剤に添加し、異なる軸子誘導経路の役割を評価することができる。この方法は、成長する軸子を軸視するのではなく、軸が通過する局所的な微小環境の多くを維持し、その軌道に沿った複数のポイントで軸を評価するという利点があります。また、軸ゴンの特定のサブセットに対する影響を識別することもできます。例えば、CXCR4の阻害は、心室ではなく、中脳内の軸ゴンが依然として経体的に成長する原因となるが、既に心内から出ている軸ゴンは影響を受けない。

通常の結果:図 1は実験の概略図を提供します。マウスのE9.5の早い段階から始まり、最初の軸索は、オキュロモーター核26から出現し始める。E10.5では、初期の開拓ニューロンを含む筋状のオキュロ運動神経が間葉内で見られる。E10.5の胚間には、神経が軌道に向かってどの程度進歩したか(同じゴミの中でも)に大きなばらつきがあり、数時間の発達差が?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

ex vivoスライスアッセイは、オキュロ運動神経の成長をリアルタイムで画像化することを可能にします。スライスは、E10.5 IslMN:GFP胚をアガロースに埋め込み、ビブラートームをスライスし、ステージトップインキュベーターで成長することによって生成されます。軸ゾン誘導経路の役割は、培養培養培養物に阻害剤を添加することによって評価される。

オキュロ運動神経増殖のタイムラプスイメージングのための胚性GFP発現マウスからのEx Vivo Oculomotorスライス培養

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

このプロトコルは、眼神経神経で活性な軸索誘導経路を同定し、リアルタイムで神経軌道に沿った異なる点での役割を評価することを可能にする。この手法は、軸索が移動するローカル環境と最終目標を維持します。成長する軸索は切断されないので、再生ではなく最初の軸索の成長を評価することができます。この方法は、眼運動系における軸索誘導に関する洞察を提供するが、他の神経の軸索誘導の研究に適応することができる。このテクニックは、習得するために練習を必要とし、迅速に作業することは非常に重要です。初めて試すときは、ゴミ全体ではなく、わずか数個の胚を使用してください。処置を開始する前に、まず、時交から胚10.5日目に超音波で妊娠を確認する。胚を収穫し、妊娠中のマウスの腹部に70%エタノールを吹き付け、そしてはさみを使って腹腔を開けて子宮を抽出する。新鮮な氷冷HBSSの第二のペトリ皿に臓器を入れる前に、氷冷HBSSのペトリ皿で子宮を洗います。解剖スコープの下で、子宮角とその個々の羊膜嚢から胚を取り除き、各胚を12ウェルプレートの蓋の下側に置き、収穫する。濾紙を使用して、胚自体に触れることなく、各胚を取り巻く液体を除去し、4%低融解アガロースの液体中に胚を水没させます。氷の上にプレートの蓋を置き、アガロースを固めます。アガロースが硬化したら、胚をひっくり返し、各サンプルの反対側を追加のアガロースで覆う。アガロースの第2の体積が固まったら、各胚がビブラートの段階で適切に配向されるように、各胚の周りにアガロースをトリミングするために蛍光解剖顕微鏡を使用する。オキュロモーター核と初期軸索の成長は蛍光であるべきである。各胚を整列させ、核、成長する軸索、および目が線を形成するようにし、カミソリの刃を使用してこの線に平行にアガロースをトリミングする。次に、ビブラートメチャンバーに氷冷スライスバッファーを充填し、最初の胚をビブラームステージにスーパーグルーして、ブレードが眼球運動核および眼と平行になるようにします。スーパーグルーが乾燥したら、ビブラートのステージを浸し、胚がブレードから離れて向くようにし、新しいビブラートメブレードを使用して400〜450マイクロメートルのスライスを得る。滅菌移動ピペットを使用して、各スライスを取得時に冷たいスライスバッファーに移し、蛍光解剖顕微鏡を使用して、オキュロモーター核および眼を含むスライスを選択します。滅菌移動ピペットを使用して、1.5ミリリットルの培養培地を含む6ウェルプレート内の細胞培養インサートにスライスを移し、プレートを37°Cインキュベーターに入れる。ビブラートメステージから残ったアガロースを取り除き、次の胚をステージにスーパーグルーし、すべての胚が切り離されメッキされるまでスライスを収集し続けます。次に、目的の阻害剤または組換え分子の適切な濃度を加え、適切な溶媒に希釈し、各ウェルの培地に添加する。線量応答曲線を作成します。スライスを相コントラストと蛍光顕微鏡で30分ごとに最大72時間画像化します。子宮内正常な開発中に、この代表的なスライス培養で観察されるように、最初の緑色蛍光タンパク質陽性眼運動軸索は、最終標的に分岐する前に胚性11.5日目までに軌道に到達する。ビブラートのステージ上のスライスの向きは、それらが正しく向いていない場合、スライスが解釈できないので、重要です。例えば、胚がその側に傾いている場合、スライス内で1つの眼運動核のみが観察される。埋め込まれた胚が背中に向かって傾き過ぎると、目はスライス内に存在せず、代わりに上肢と後脳または脊髄が含まれる可能性があります。また、スライスを培養膜に配置する際に、組織が折り畳まれないように注意することも重要です。有機溶剤中の阻害剤や成長因子を溶解する際には注意してください。例えば、この実験では、スライスは培地にエタノールを添加した後に死んだ。氷の上にすべてを維持し、胚の抽出とインキュベーターにスライスを配置する時間を最小限に抑えることを忘れないでください。この技術を用いて、眼運動システムで働く軸索誘導機構を同定し始めた。カミソリの刃を扱うときは注意して、一部の阻害剤は危険であり、安全プロファイルに従って慎重に取り扱う必要があります。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

末梢神経突起伸長のリアルタイムイメージングのためのGFP発現マウス胚の器官型スライス培養

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

神経科学

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes：眼球運動実験のためのモジュラ式のソフトウェアシステム

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker、眼球運動解析への革新的な自動化されたアプローチ

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

生体産後エレクトロポレーションおよびマウスの急性脳スライスにおける神経芽細胞移動のタイムラプスイメージング中

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Ex Vivoイメージング実験アダルト ゼブラフィッシュから準備新鮮な網膜スライス

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...