Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

국립안과 학회 [5K08EY027850], 국립아동보건개발원 [U54HD090255], 하버드-비전 임상과학자 개발 프로그램 [5K12EY016335], 기사단 원안재단 [커리어 스타터] [교수 발견상], 어린이 병원 안과 재단 ECE는 하워드 휴즈 의학 연구소 조사관입니다.

여기에 설명된 모든 동물 작업은 보스턴 아동 병원 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜을 준수하여 승인및 수행되었습니다.
1. 시간 적시 짝짓기
<ol><li>장소 ISLMN:GFP (아일렛 모터 뉴런 녹색 형광 단백질; MGI: J:132726; Jax Tg (Isl-EGFP*)1Slp/J 스톡 번호: 017952)수컷 및 암컷 마우스를 하룻밤 동안 함께. 짝짓기 전에 암컷의 무게와 기록...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

이러한 생체내 슬라이스 배양 프로토콜은 전통적인 축삭유도 분석(23)에 비해 상당한 이점을 제공한다. 각 두개골 운동 핵의 크기는 제한 요인이 아니며 어려운 해부가 필요하지 않습니다. 축사 이동을 통해 내인성 미세 환경은 다른 신호 경로를 유지하면서 하나의 신호 통로의 수정을 허용. 또한 축색 궤적을 따라 다른 지점에서 효과를 평가할 수 있습니다. 축색 안내는 경로<sup ...

안구 모터 시스템은 축색 가이던스 메커니즘을 조사하기 위한 우아한 시스템을 제공합니다. 그것은 눈을 움직이는 6개의 외눈 근육 (EOMs)를 심두는 3개의 두개골 신경 및 눈꺼풀을 들어 올리는 levator palpebrae 우월증 (LPS)로 이루어져 있는 상대적으로 복잡하지 않습니다. oculomotor 신경은 LPS와 4개의 EOMs를 내심합니다 - 열등한 경사및 내측, 열등한, 및 우수한 직류 근육. 다른 두 신경, trochlear 및 abducens, 각각 하나의 근육을 내면, 우수한 경사 및 측면 직사각형 근육, 각각. 눈의 움직임은 쉽게 판독할 수 있으며, 내면이 적절한지, 누락되었는지, 또는 비정상적인지를 보여 줄 수 있습니다. 추가적으로, 선천적인 두개골 배화 무질서 (CCDDs)를 집합적으로 불리는 신경 발달 또는 축세포 지도에 있는 적자에서 유래하는 인간 눈 운동 무질서가있습니다1.
이러한 장점에도 불구하고, 안구 모터 시스템은 거의 축사 유도 연구2,3,4,5,6,7,8에사용되지않습니다. 9개 , 10, 기술적 인 단점으로 인해. 시험관 내 축색안내는 많은 단점을 가지고11. 공동 배양 분석, 있는 뉴런 이식 대상 조직12 또는 형질 감염 세포13의이종과 함께 배양되는, 이식의 대칭 과 이식 과 표적 조직 사이의 정확한 위치 모두에 의존한다. 스트라이프 어세이14,15, 두 개의 큐가 교대로 줄무늬에 배치되고 축사가 하나의 스트라이프에 우선 성장을 위해 평가되는 경우, 하나의 기판이 다른 기판보다 바람직하다는 것을 나타냅니다. 또는 반발, 또는 생리학적으로 관련이 있습니다. 미세 유체 챔버는 정확한 화학 구배를 형성 할 수 있지만, 대상 성장 축은 응력16,17,18을전단, 이는 자신의 성장에 영향을 미칠 수 있습니다. 더욱이, 이 접근의 각각에서, 이식 또는 해리세포를 수집하는 것은 성장하는 축삭이 축삭을 축삭화하고 따라서 이 계산이 실제로 초기 축삭 자성장 보다는 오히려 축삭 재생을 검토한다는 것을 요구합니다. 마지막으로, 이러한 시험관 내 접근법은 축축한 축세포에 영향을 미치는 미세 환경을 제거하고 코스의 다른 지점을 따라 큐에 대한 반응, 전통적으로 격리된 하나의 큐만 테스트합니다. 이러한 단점을 복합화, 안구 모터 시스템에서 각 핵의 작은 크기는 해부 기술적으로 이식 또는 해리 된 문화에 대한 도전한다. 추가적으로, 안구 운동 뉴런의 1 차적인 배양은 일반적으로 이질적이고, 중요한 세포 죽음이 있고, 다중 태아에게서 세포의 풀링을 요구하는 밀도 의존적입니다 (료스키 후지키, 개인적인 커뮤니케이션). 그러나 녹아웃 마우스 모델을 포함한 생체 내 방법은 필요한 시간과 비용을 감안할 때 스크리닝에 사용하기에 적합하지 않습니다.
배양 전체 배아19에 개발된 방법은 이동 세포20의 라벨링 또는 특정 분자21의봉쇄를 허용하지만, 전체 배아 배양은 라벨의 실시간 이미징을 배제하는 롤러 병에서 배양을 필요로 합니다. 구조. 태아의 조작을 허용하고 그 후에 추가 발달을 허용하는 외과 기술은 자궁에서 또는 어머니의 복부에 있는 (태반 연결을 유지함)22또한 가능합니다, 그러나 이들은 또한 시간 경과를 허용하지 않습니다 이미징.
시험관내 분석의 장애물을 극복하고 신호 경로의 신속한 스크리닝을 허용하기 위해, 생체내 배아 슬라이스 배양 기법은23,말초 신경 발생에 대한 이전에 발표된 프로토콜로부터 적응된24. 이 프로토콜을 사용하여, 개발 oculomotor 신경은 EOM 표적을 포함하여 그것의 궤도를 따라 그것의 궤도의 많은 의 존재에서 시간이 지남에 따라 영상화될 수 있습니다. 배양 배지에 소분자 억제제, 성장 인자 또는 안내 신호를 추가함으로써 축색 궤적을 따라 여러 지점에서 지침 교란을 평가하여 잠재적 인 성장 및 지침 요인을 보다 신속하게 평가할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

정확한 눈 움직임은 시력에 매우 중요하지만, 안구 모터 시스템, 특히 축사 지도를 제어하는 분자 경로의 개발은 완전히 해명되지 않았습니다. 이것은 부분적으로 전통적인 축색 지도 방법의 기술적인 한계 때문이. 오큘로모터 신경에 영향을 미치는 추가적인 축삭 유도 신호를 식별하기 위해, 눈쪽으로 성장함에 따라 실시간으로 오큘로모터 신경을 이미지화하는 생체내 슬라이스 분석법이 개발되었다. E10.5 IslMN-GFP 배아는 아가로오스에 포함시키고, 진동체에 슬라이스한 다음, 24-72시간 동안 타임랩스 광현미경으로 현미경 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시켜 생체 내 조각을 생성하는 데 사용됩니다. 핵에서 궤도에 축산의 성장의 생체 내 타이밍. 소분자 억제제 또는 재조합 단백질은 배양 배지에 첨가되어 상이한 축세포 유도 경로의 역할을 평가할 수 있다. 이 방법은 축슨이 통과하는 국소 미세 환경을 더 많이 유지하고 성장하는 축축을 축축화하지 않고 궤적을 따라 여러 지점에서 축을 평가하는 장점이 있습니다. 또한 축색의 특정 하위 집합에 미치는 영향을 식별할 수 있습니다. 예를 들면, CXCR4의 억제는 통풍구보다는 오히려 등등 성장하는 중뇌 안에 아직도 축을 일으키는 원인이 됩니다, 그러나 이미 통풍구로 종료한 축산은 영향을 받지 않습니다.

일반 결과: 그림 1은 실험의 개략적 을 제공합니다. 마우스에서 E9.5부터 시작하여, 첫 번째 축색은 oculomotor 핵26에서나오기 시작합니다. E10.5에 의해, 초기 개척자 뉴런을 포함하는 매혹적인 oculomotor 신경은, 중간엽에서 볼 수 있습니다. E10.5에서 배아 사이의 상당한 가변성이 있다 (심지어 같은 쓰레기 내에서) 얼마나 멀리 신경 궤도쪽으로 진행 되었습니다., ...

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Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

ex vivo 슬라이스 분석은 oculomotor 신경 성장을 실시간으로 심상화할 수 있게 합니다. 슬라이스는 E10.5 IslMN:GFP 배아를 아가로오스에 포함시키고, 진동을 슬라이스하고, 스테이지 탑 인큐베이터에서 성장시킴으로써 생성됩니다. 축색 유도 경로의 역할은 배양 배지에 억제제추가에 의해 평가됩니다.

배아 GFP 발현 마우스에서 전 Vivo Oculomotor 슬라이스 배양 Oculomotor 신경 파생의 시간 경과 화상 진찰을 위한

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

이 프로토콜은 우리가 oculomotor 신경에서 활성화된 축축안내 통로를 확인하고 신경 궤적을 따라 다른 지점에서 그들의 역할을 실시간으로 평가할 수 있게 합니다. 이 기술은 축축이 이동하는 로컬 환경과 최종 목표를 보존합니다. 성장하는 축축은 절단되지 않으므로 초기 축축은 재생이 아닌 초기 축축을 평가할 수 있습니다.이 방법은 안구 모터 시스템의 축 하 안내에 대 한 통찰력을 제공 하지만 다른 신경의 축 하 지침의 연구에 적응 될 수 있습니다. 이 기술은 마스터 연습을 소요하고, 신속하게 작업하는 것은 매우 중요하다. 처음으로 그것을 시도할 때, 전체 쓰레기보다는 단지 몇 개의 배아를 사용하십시오.절차를 시작하기 전에, 먼저 시간 제짓 짝짓기에서 배아 일 10.5에 초음파에 의한 임신을 확인하십시오. 배아를 수확하고, 임신한 마우스의 복부를 70%에탄올로 분사하고, 가위를 사용하여 복강을 열어 자궁을 추출한다. 신선한 얼음 차가운 HBSS의 두 번째 페트리 접시에 오르간을 배치하기 전에 얼음 차가운 HBSS의 페트리 접시에 자궁을 씻어.해부 범위 하에서, 자궁 뿔과 그들의 개별 양수 낭에서 배아를 제거, 그들은 수확으로, 얼음에, 12 웰 플레이트의 뚜껑의 아래쪽에 각 배아를 배치. 필터 용지를 사용하여 배아를 스스로 만지지 않고 각 배아를 둘러싼 액체를 제거하고 배아를 액체 4% 저용 아가로즈에 담급하십시오. 접시 뚜껑을 얼음 위에 놓아 아가로즈를 고화시합니다.아가로즈가 굳어지면 배아위로 뒤집어 각 시료의 반대편을 추가 아가로즈로 덮습니다. 아가로즈의 두 번째 부피가 고화되면 각 배아 주위의 아가로즈를 다듬기 위해 형광 해부 현미경을 사용하여 각 배아가 진동 단계에서 올바르게 지향되도록 합니다. 오큘로모터 핵과 초기 축축기 의 성장은 형광이어야한다.각 배아를 정렬하여 핵, 축축및 눈이 선을 형성하고 면도날을 사용하여 이 선과 평행하게 아가로즈를 다듬습니다. 다음으로, 진동 챔버를 얼음 냉간 슬라이스 버퍼로 채우고, 블레이드가 오큘러모터 핵 및 눈과 평행할 수 있도록 첫 번째 배아를 진동 단계에 초접착제로 한다. 초접착제가 건조하면 진동단계를 잠수하여 배아가 블레이드에서 멀어지도록 하고 새로운 진동블레이드를 사용하여 400-450 마이크로미터 슬라이스를 얻습니다.멸균 전달 파이펫을 사용하여 각 슬라이스를 차가운 슬라이스 버퍼로 옮기고, 형광 해부 현미경을 사용하여 오큘로모터 핵과 눈을 포함하는 슬라이스를 선택한다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여, 슬라이스를 셀 배양 인서트에 잘 1.5 밀리리터의 배양 배지를 함유한 6웰 플레이트에 옮기고, 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다. 진동 단계에서 잔류 아가로즈를 제거하고 다음 배아를 무대에 초접착제로 제거하고 모든 배아가 절제되고 도금될 때까지 조각을 계속 수집합니다.그런 다음 적절한 용매로 희석된 관심있는 억제제 또는 재조합 분자의 적절한 농도를 각각의 우물의 배지에 첨가한다. 용량 응답 곡선을 만듭니다. 최대 72시간 동안 위상 대비 및 형광 현미경 검사법에 따라 30분마다 슬라이스를 이미지합니다.자궁 발달에서 정상 동안, 첫 번째 녹색 형광 단백질 양성 oculomotor 축축작은 배아 일 11.5에 의해 궤도에 도달하여 최종 표적으로 분기하기 전에, 이 대표적인 슬라이스 문화에서 관찰된 바와 같이. 조각이 제대로 방향이 아닌 경우 해석할 수 없기 때문에 진동 단계의 슬라이스 방향은 매우 중요합니다. 예를 들어, 배아가 옆으로 기울어지면, 슬라이스 내에서 하나의 오큘로모터 핵만 관찰될 것이다.임베디드 배아가 뒤쪽으로 너무 멀리 기울어지면, 눈은 슬라이스 안에 나타나지 않으며, 대신 상두부와 뒤뇌 또는 척수를 포함할 수 있다. 또한 배양막에 슬라이스를 배치하는 동안 조직이 접히지 않도록주의하는 것이 중요합니다. 유기 용매의 억제제 및 성장 인자를 용해 할 때주의하십시오.예를 들어, 본 실험에서, 슬라이스는 매체에 에탄올을 첨가한 후에 죽었다. 모든 것을 얼음 위에 보관하고 배아를 추출하고 배양기에서 슬라이스를 배치하는 시간을 최소화해야 합니다. 이 기술을 사용하여 안구 모터 시스템에서 작업시 추가 축하 유도 메커니즘을 식별하기 시작했습니다.면도날로 작업할 때주의해야 하며 일부 억제제는 위험할 수 있으며 안전 프로필에 따라 신중하게 처리해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

연구

신경과학

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Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

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The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

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