Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Finansiering gitt av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child helse og utvikling [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical forsker Development program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [karriere starter Grant], og Children ' s Hospital Oftalmologi Foundation [fakultet Discovery Award]. ECE er en Howard Hughes Medical Institute etterforsker.

Alle dyr arbeidet beskrevet her ble godkjent og utført i samsvar med Boston Children ' s Hospital institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) protokoller.
1. tidsbestemt siamesere
<ol><li>Sted ISLMN: GFP (Islet motor Nevron grønt fluorescerende protein; MGI: J:132726; JAX TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock no: 017952) mannlige og kvinnelige mus sammen over natten. Veie hunnene og registrere vekter før paring. Merk: ISLMN...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Denne ex vivo Slice kultur-protokollen gir betydelige fordeler i forhold til tradisjonelle axon veiledning analyser23. Størrelsen på hver skallen motor kjernen er ikke en begrensende faktor, og ingen vanskelig disseksjon er nødvendig. Den endogene mikromiljøet gjennom som axons reise opprettholdes, slik at modifisering av en signalering sti og samtidig opprettholde andre signalering trasé. I tillegg kan effekter vurderes på ulike punkter langs axon banen. Siden axon veiledning krever flere s...

Øye motorsystemet gir et elegant system for å undersøke axon veilednings mekanismer. Det er relativt ukomplisert, bestående av tre skallen nerver innervating seks ekstraokulære muskler (EOMs) som beveger øyet, og levator palpebrae superioris (LPS) som løfter øyelokket. Den nervus nerve innerverer LPS og fire EOMs-den underlegne skrå og midtre, dårligere, og overlegen Rectus muskler. De to andre nerver, den trochlear og abducens, hver eneste innervate en muskel, overlegen skrå og lateral Rectus muskel, henholdsvis. Eye bevegelser gir en enkel avlesning, viser om innervasjon var hensiktsmessig, mangler, eller avvikende. I tillegg er det menneskelige øyebevegelse lidelser som følge av underskudd i neuronal utvikling eller axon veiledning, kollektivt betegnet de medfødte skallen disinnervation lidelser (CCDDs)1.
Til tross for disse fordelene brukes øye motorsystemet sjelden i axon veilednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 andre priser , 10, på grunn av tekniske ulemper. I vitro axon veiledning analysene har mange ulemper11. Co-kultur analyser, der neuronal explants er kultivert sammen med explants av målet vev12 eller transfekterte celler13, avhengig av både symmetri av explant og presis posisjonering mellom explant og målet vev. Stripe analyser14,15, der to Stikkordene er fastsatt i vekslende striper og axons er vurdert for fortrinnsrett vekst på en stripe, bare tyder på at ett substrat er å foretrekke fremfor den andre, ikke at enten er attraktiv eller frastøtende, eller fysiologisk relevant. Materialer Chambers kan danne presise kjemiske graderinger, men underlagt økende axons å skjær stress16,17,18, noe som kan påvirke deres vekst. Videre, i hver av disse tilnærmingene, samle explants eller dissosiert celler krever at outgrowing axons være axotomized og dermed disse analysene faktisk undersøke axon regenerering, snarere enn første axon utvekst. Til slutt, disse in vitro tilnærminger fjerne mikromiljøet som påvirker axons og deres svar på stikkordene langs forskjellige steder av deres kurs, og tradisjonelt bare teste en kø i isolasjon. Compounding disse ulempene, gjør den lille størrelsen på hver kjerne i øye motorsystemet disseksjon teknisk utfordrende for enten explants eller dissosiert kulturer. I tillegg er primære kulturer av øye motor neurons vanligvis heterogene, har betydelig celle død, og er tetthet avhengig, krever pooling av celler fra flere embryo (Ryosuki FUJIKI, personlig kommunikasjon). In vivo metoder, men inkludert knockout musemodeller, er upassende å bruke for screening, gitt den tid og utgifter som kreves.
Metoder utviklet for å kultur hele embryo19 tillate merking av å migrere celler20 eller blokade av spesifikke molekyler21, men hele embryo kulturer krever inkubasjons i rulle flasker som utelukker sanntids Imaging av merket Strukturer. Kirurgiske teknikker som tillater manipulering av embryo og deretter påfølgende videre utvikling enten i livmoren eller i magen av moren (opprettholde placenta)22 er også mulig, men disse heller ikke tillate time-lapse Imaging.
For å overvinne hindringene for in vitro analyser og tillate rask screening av signalering trasé, en ex vivo embryonale skjær kultur teknikk ble utviklet23, tilpasset fra en tidligere publisert protokoll for perifer nerve utvekst24. Ved hjelp av denne protokollen, kan utvikle nervus nerve bli avbildet over tid i nærvær av mange av de omkringliggende strukturer langs banen, inkludert EOM mål. Ved å legge til små molekyl hemmere, vekstfaktorer, eller veiledning signaler til kulturen Media, kan vi vurdere veiledning forstyrrelser på flere punkter langs axon banen, slik at mer rask vurdering av potensiell vekst og veiledning faktorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Nøyaktige øyebevegelser er avgjørende for synet, men utviklingen av øye motorsystemet, spesielt de molekylære veiene som kontrollerer axon veiledning, har ikke blitt fullstendig belyst. Dette skyldes delvis tekniske begrensninger i tradisjonelle axon veilednings analyser. For å identifisere flere axon veiledning pekepinner påvirke nervus nerve, en ex vivo Slice analysen til bildet nervus nerve i sanntid som det vokser mot øyet ble utviklet. E 10.5 ISLMN-GFP embryo brukes til å generere ex vivo skiver ved å bygge dem inn i agarose, kutting på en vibratome, deretter vokser dem i et mikroskop stadium-topp inkubator med time-lapse photomicroscopy for 24-72 h. kontroll skiver recapitulate i vivo timing av utvekst av axons fra kjernen til banen. Små molekyl hemmere eller rekombinant proteiner kan legges til kulturen Media for å vurdere hvilken rolle ulike axon veiledning trasé. Denne metoden har fordelene med å opprettholde mer av de lokale mikromiljøet gjennom hvilke axons Travers, ikke axotomizing den voksende axons, og vurdere axons på flere punkter langs deres bane. Det kan også identifisere effekter på bestemte delsett av axons. For eksempel, hemming av CXCR4 årsaker axons fortsatt innenfor mellomhjernen å vokse dorsalt stedet ventrally, men axons som allerede har gått ut ventrally er ikke berørt.

Normal resultater: figur 1 gir et skjematisk av eksperimentet. Starter så tidlig som E 9.5 i mus, den første axons begynner å dukke opp fra nervus kjernen26. Ved E 10.5, en fasciculated nervus nerve, som inneholder de tidlige pioner neurons, kan sees i mesenchyme. Det er betydelig variasjon mellom embryo på E 10.5 (selv innenfor samme kull) i hvor langt nerve har kommet mot banen, sannsynligvis på grunn av utviklingsmessige forskjeller på noen timer. Under norma...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

En ex vivo Slice analysen lar nervus nerve utvekst å bli avbildet i sanntid. Sektorer genereres ved å bygge inn E 10.5 ISLMN: GFP embryo in agarose, kutting på en vibratome, og vokser i en scene-topp inkubator. Rollen til axon veilednings trasé vurderes ved å legge til hemmere i kultur mediene.

Ex vivo nervus Slice kultur fra embryonale GFP-uttrykker mus for time-lapse Imaging av nervus nerve utvekst

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Denne protokollen tillater oss å identifisere axon veiledningsveier som er aktive i oculomotornerven og å vurdere sine roller på forskjellige punkter langs nervebanen i sanntid. Denne teknikken bevarer de lokale miljøene gjennom hvilke aksoner reiser og deres endelige mål. De voksende aksonene er ikke kuttet, så innledende aksonvekst, i stedet for regenerering, kan vurderes.Denne metoden gir innsikt i axon veiledning i okulær motorsystemet, men kan tilpasses studiet av axon veiledning av andre nerver. Denne teknikken tar praksis for å mestre, og å jobbe raskt er ekstremt viktig. Når du prøver det for første gang, bruk bare noen få embryoer, i stedet for et helt kull.Før du begynner prosedyren, må du først bekrefte graviditeten ved ultralyd på embryonisk dag 10,5 fra en tidsstet parring. Høst embryoene, spray magen til den gravide musen med 70% etanol, og bruk saks for å åpne bukhulen for å trekke ut livmoren. Vask livmoren i en petriskål med iskald HBSS før du plasserer orgelet i en annen petriskål med frisk iskald HBSS.Under et dissekeringsområde fjerner du embryoene fra livmorhornet og deres individuelle fostersekker, plasserer hvert embryo på undersiden av lokket på en 12-brønns tallerken, på is, da de høstes. Bruk filterpapir for å fjerne væske rundt hvert embryo, uten å berøre embryoene selv, og senk embryoene i flytende 4% lavtsmeltende agarose. Legg platelokket på isen for å størkne agarose.Når agarose har herdet, snu embryoene og dekk den andre siden av hver prøve med ekstra agarose. Når det andre volumet av agarose har størknet, bruk et fluorescensspisseksjonsmikroskop for å trimme agarose rundt hvert embryo slik at hvert embryo vil bli orientert riktig på vibratomstadiet. Oculomotorkjerner og tidlig aksonvekst bør være fluorescerende.Juster hvert embryo slik at kjernen, utvoksende aksoner og øye danner en linje, og bruk et barberblad for å trimme agarose parallelt med denne linjen. Fyll deretter vibratomkammeret med iskald skivebuffer, og superlim det første embryoet til vibratomstadiet slik at bladet vil være parallelt med oculomotorkjernen og øynene. Når superlimet er tørt, senk vibratomestadiet slik at embryoet er orientert vendt bort fra bladet, og bruk et nytt vibratomblad for å oppnå 400-til 450-mikrometerskiver.Bruk en steril overføringspipette til å overføre hver skive til kald kuttbuffer når den anskaffes, og bruk fluorescensspissende mikroskop til å velge skiven som inneholder oculomotorkjerner og øyne. Bruk en steril overføringspipette til å overføre skiven til en cellekulturinnsats i en seksbrønnsplate som inneholder 1,5 milliliter kulturmedium per brønn, og plasser platen i en 37-graders Celsius inkubator. Fjern rester agarose fra vibratom scenen, og superlim neste embryo på scenen, fortsetter å samle skiver til alle embryoene er seksjonert og belagt.Tilsett deretter riktig konsentrasjon av inhibitoren eller rekombinant molekyl av interesse, fortynnet i et passende løsningsmiddel, til mediet for hver brønn. Opprett en doseresponskurve. Bilde skivene hvert 30.Under normal utvikling av utero når de første grønne fluorescerende proteinpositive oculomotoraksonene banen ved embryonisk dag 11,5 før de forgrener seg til sine endelige mål, som observert i denne representative skivekulturen. Orienteringen av skiven på vibratomestadiet er avgjørende, da skivene ikke kan tolkes hvis de ikke er riktig orientert. For eksempel, hvis embryoet er vippet til siden, vil bare en oculomotorkjerne bli observert i skiven.Hvis det innebygde embryoet vippes for langt mot ryggen, vil øynene ikke være tilstede i skiven, og i stedet kan øvre lem og bakbrain eller ryggmarg være inkludert. Det er også viktig å ta vare på at under plasseringen av skiven på kulturmembranen, at vevet ikke blir brettet. Vær forsiktig når du løser opp hemmere og vekstfaktorer i organiske løsemidler.For eksempel, i dette eksperimentet døde skiven etter tilsetning av etanol til mediet. Husk å holde alt på is og for å minimere tiden mellom ekstraksjon av embryoene og plassere skivene i inkubatoren. Ved hjelp av denne teknikken har vi begynt å identifisere flere axon veiledningsmekanismer på jobb i det okulære motorsystemet.Husk å være forsiktig når du arbeider med barberblad, og at noen inhibitorer kan være farlige og bør håndteres nøye i henhold til deres sikkerhetsprofiler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: En Modular Software System for oculomotor Eksperimentering

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor Nerve transection og Time-lapse Imaging av Glial Cell atferd Live Sebrafisk

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation og Time-lapse Imaging av neuroblast Migration in Mouse Akutt Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo avbildning av Optic Nerve Fiber Integritet av Kontrast-forsterket MR i Mus

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging av Migrating Neurons i Organotypic Slice Kultur av Embryonic Mouse Brain Using<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporasjon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Forberede frisk Retinal skiver fra voksne sebrafisk for Ex Vivo Imaging eksperimenter

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation og Organotypic stykke kulturer embryonale musen hjerner for Live-Imaging av overføring av GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...