Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Финансирование, предоставляемое Национальным институтом глаз (5K08EY027850), Национальным институтом детского здоровья и развития (U54HD090255), Гарвардской клинической научной программой развития (5K12EY016335), Фондом тамплиеров «Карьера Стартера» Гранта, и Детский больничный офтальмология Фонда «Факультет Открытие премии». ECE является Говард Хьюз медицинский институт следователя.

Все работы по уходу за животными, описанные здесь, были утверждены и выполнены в соответствии с протоколами Бостонской детской больницы по уходу за животными и использованию (IACUC).
1. Приуроченные спаривания
<ol><li>Место ISLMN:GFP (Islet Motor Нейрон Зеленый флуоресцентны?...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Этот протокол культуры культуры ex vivo обеспечивает значительные преимущества по сравнению с традиционными аксоновыми инструкциями23. Размер каждого черепного опрокидного ядра не является ограничивающим фактором, и никакого сложного вскрытия не требуется. Эндогенная микр...

Глазная моторная система обеспечивает элегантную систему для исследования механизмов наведения аксона. Это относительно несложный, состоящий из трех черепных нервов, иннервирующих шесть экстраокулярных мышц (EOMs), которые двигают глаз, и леватор palpebrae superioris (LPS), который поднимает век. Окуломоторный нерв иннервирует LPS и четыре EOMs - нижние косые и медиальный, нижний, и превосходные мышцы прямой кишки. Два других нерва, trochlear и abducens, каждый только innervate одной мышцы, выше косой и боковой мышцы прямой кишки, соответственно. Движения глаз обеспечивают легкое считывание, показывая, если иннервация была уместной, отсутствует, или аномальные. Кроме того, Есть человеческие расстройства движения глаз, которые являются результатом дефицита в развитии нейронов или аксон руководства, коллективно называют врожденные расстройства дезиннервации черепа (CCDDs)1.
Несмотря на эти преимущества, глазная моторная системаредко используется в исследованиях аксона 2,3,4,5,6, 8, 9 До 9 , 10, из-за технических недостатков. In vitro axon руководство анализы имеют много недостатков11. Анализы сокультуры, в которых нейрональные экспланты культивируются вместе с высадками целевой ткани12 или транс-инфицированных клеток13,зависят как от симметрии экспланта, так и от точного позиционирования между эксплантировой и целевой тканью. Полоса анализы14,15, в котором два сигнала изложены в чередующихся полос и аксонов оцениваются для преференциального роста на одной полосе, только указывают, что один субстрат предпочтительнее другого, не то, что либо является привлекательным или отталкивающим, или физиологически актуальным. Microfluidics камеры могут образовывать точные химические градиенты, но при условии выращивания аксонов сдвига стресс16,17,18, которые могут повлиять на их рост. Кроме того, в каждом из этих подходов, сбор explants или диссоциированных клеток требует, чтобы перерастания аксонов быть акотомизированы и, таким образом, эти анализы на самом деле изучить аксон регенерации, а не первоначальный аксон рост. Наконец, эти подходы in vitro удаляют микросреду, которая влияет на аксоны и их реакцию на сигналы по разным точкам их курса, и традиционно тестируют только один сигнал в изоляции. Усугубляя эти недостатки, небольшой размер каждого ядра в глазной двигательной системе делает вскрытие технически сложным для эксплантированных или диссоциированных культур. Кроме того, первичные культуры глазных моторных нейронов, как правило, неоднородны, имеют значительную гибель клеток, и зависят от плотности, требуя объединения клеток из нескольких эмбрионов (Ryosuki Fujiki, личное общение). In vivo методы, однако, в том числе нокаут мыши модели, не уместны для использования для скрининга, учитывая время и расходы, необходимые.
Методы, разработанные для культуры целых эмбрионов19 позволяют маркировки мигрирующих клеток20 или блокады конкретных молекул21, но целые культуры эмбриона требуют инкубации в роликовых бутылках, что исключает в режиме реального времени изображения помечены Структуры. Хирургические методы, которые позволяют манипуляции эмбриона, а затем последующее дальнейшее развитие либо в матке или в брюшной полости матери (поддержание плацентарной связи)22 также возможны, но они также не позволяют промежуток времени Изображений.
Чтобы преодолеть препятствия in vitro анализы и позволяют быстрый скрининг сигнальных путей, ex vivo эмбриональных срез культуры техника была разработана23, адаптированы из ранее опубликованного протокола для периферических нервных нарастания24. Используя этот протокол, развивающийся окуломоторный нерв может быть изображен с течением времени в присутствии многих окружающих структур по его траектории, включая цели EOM. Добавляя небольшие молекулярные ингибиторы, факторы роста или сигналы руководства к культурным носителям, мы можем оценить возмущения руководства в нескольких точках вдоль траектории аксона, что позволяет более быстро оценивать потенциальные факторы роста и руководства.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Точные движения глаз имеют решающее значение для зрения, но развитие глазной двигательной системы, особенно молекулярных путей контроля аксон руководства, не были полностью выяснены. Отчасти это связано с техническими ограничениями традиционных аксонов. Для выявления дополнительных аксонов наведения сигналы, влияющие на окуломоторный нерв, ex vivo ломтик асссе для изображения окуломоторного нерва в режиме реального времени, как он растет к глазу был разработан. E10.5 IslMN-GFP эмбрионы используются для создания ex vivo ломтики путем встраивания их в агарозу, нарезка на вибратом, а затем выращивать их в микроскоп этапе инкубатор с замедленной фотомикроскопии для 24-72 ч. Контроль ные части recapitulate in vivo синхронизации нарастания аксонов от ядра до орбиты. Небольшие молекулярные ингибиторы или рекомбинантные белки могут быть добавлены в культурные носители для оценки роли различных путей наведения аксона. Этот метод имеет преимущества поддержания большей части локальной микросреды, через которую пересекают аксоны, а не аксотомизации растущих аксонов, и оценки аксонов в нескольких точках по их траектории. Он также может определить влияние на конкретные подмножества аксонов. Например, ингибирование CXCR4 вызывает аксоны еще в середине мозга расти дорсально, а не венттально, но аксоны, которые уже вышли венттально не влияет.

Нормальные результаты: Рисунок 1 обеспечивает схему эксперимента. Начиная с E9.5 в мыши, первые аксоны начинают выходить из окуломоторного ядра26. По E10.5, фасцилуляционный окуломоторный нерв, который содержит ранние пионерские нейроны, можно увидеть в мезенхи?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Экзвио ломтик асссе позволяет oculomotor нервный рост, чтобы быть изображены в режиме реального времени. Фрагменты генерируются путем встраивания E10.5 IslMN:GFP эмбрионов в агарозе, нарезки на вибратом, и растет в стадии верхней инкубатора. Роль аксонов пути руководства оценивается путем добавления ингибиторов в культуре средств массовой информации.

Ex Vivo Oculomotor Slice Культура от эмбриональных GFP-Expressing мышей для Time-Lapse Imaging Oculomotor Нерв Рост

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Этот протокол позволяет нам определить аксоновые пути, активные в окуломоторном нерве, и оценить их роль в разных точках по нервной траектории в режиме реального времени. Этот метод сохраняет местную среду, через которую проходят аксоны, и их конечные цели. Растущие аксоны не вырезаются, поэтому можно оценить начальный нарой аксон, а не регенерацию.Этот метод дает представление о аксон руководство в глазной двигательной системы, но может быть адаптирована к изучению аксон руководство других нервов. Этот метод требует практики, чтобы освоить, и работать быстро чрезвычайно важно. При попытке его в первый раз, использовать только несколько эмбрионов, а не весь мусор.Перед началом процедуры сначала подтвердите беременность ультразвуком на эмбриональный день 10.5 от таймингового спаривания. Урожай эмбрионов, спрей брюшной полости беременной мыши с 70% этанола, и использовать ножницы, чтобы открыть брюшную полость для извлечения матки. Вымойте матку в чашке Петри ледяной HBSS перед размещением органа во второй чашке Петри свежего ледяного HBSS.Под рассечением области, удалить эмбрионы из рога матки и их отдельных амниотических мешков, поместив каждый эмбрион на нижней стороне крышки 12-хорошо пластины, на льду, как они собирают. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить любую жидкость, окружающую каждый эмбрион, не касаясь самих эмбрионов, и погрузить эмбрионы в жидкость 4%low-melting агарозу. Поместите крышку пластины на лед, чтобы затвердеть агарозу.Когда агароза затвердеет, переверните эмбрионы и покройте другую сторону каждого образца дополнительной агарозой. Когда второй том агарозы затвердеет, используйте флуоресцентный рассеченный микроскоп, чтобы обрезать агарозу вокруг каждого эмбриона так, чтобы каждый эмбрион был правильно ориентирован на стадии вибромы. Ядра окуломотора и ранние нарости аксона должны быть флуоресцентными.Выровнять каждый эмбрион так, что ядро, перерастает аксоны, и глаз образуют линию, и использовать лезвие бритвы, чтобы обрезать агарозу параллельно этой линии. Затем заполните вибромную камеру ледяным ломтиком буфера и скоулите первый эмбрион до вибромной стадии так, чтобы лезвие было параллельно окуломотору и глазам. Когда суперклей высохнет, погрузите вибромную стадию так, чтобы эмбрион был ориентирован лицом к лезвию, и используйте новое лезвие вибромы, чтобы получить 400-450-микрометровые ломтики.Используйте стерильные пипетки передачи для передачи каждого ломтика в холодный нарезки буфера, как она приобрела, и использовать флуоресценции вскрытия микроскопа, чтобы выбрать ломтик, содержащий ядра окуломотора и глаза. Используя стерильную трубу передачи, перенесите срез на вставку клеточной культуры в шести-хорошо пластины, содержащей 1,5 миллилитров культуры среды на колодец, и поместите пластину в 37-градусный инкубатор по Цельсию. Удалите остаточную агарозу со стадии вибромы и вывемите следующий эмбрион на сцену, продолжая собирать ломтики до тех пор, пока все эмбрионы не будут разрезаны и потолкнулись.Затем добавьте соответствующую концентрацию ингибитора или рекомбинантной молекулы интереса, разбавленной соответствующим растворителем, к среде каждой хорошо. Создайте кривую реакции дозы. Изображение ломтиков каждые 30 минут путем фазового контраста и флуоресценции микроскопии на срок до 72 часов.Во время нормального развития матки, первые зеленые флуоресцентные протеин-положительные аксоны oculomotor достигают орбиты эмбриональным днем 11.5 перед разветвлением к их окончательным целям, как замечено в этой репрезентативной культуре ломтика. Ориентация ломтика на сцене виброма имеет решающее значение, так как ломтики не интерпретируются, если они не ориентированы должным образом. Например, если эмбрион наклонен в свою сторону, в срезе будет наблюдаться только одно ядро окуломотора.Если встроенный эмбрион наклонен слишком далеко к спине, глаза не будут присутствовать в ломтике, и вместо этого верхние конечности и задний мозг или спинной мозг могут быть включены. Важно также позаботиться о том, чтобы во время размещения ломтика на мембрану культуры, что ткань не складывается. Позаботьтесь при растворении ингибиторов и факторов роста органических растворителей.Например, в этом эксперименте, ломтик умер после добавления этанола в среду. Не забудьте держать все на льду и свести к минимуму время между извлечением эмбрионов и размещением ломтиков в инкубаторе. Используя этот метод, мы приступили к выявлению дополнительных механизмов наведения аксона на работе в глазной двигательной системе.Не забудьте использовать осторожность при работе с лезвиями бритвы и что некоторые ингибиторы могут быть опасными и должны быть обработаны тщательно в соответствии с их профилями безопасности.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Органотипической Анализ фрагментов для высокого разрешения Time-Lapse Визуализация миграции нейронов в послеродовой мозга

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: Модульное ПО Система глазодвигательных экспериментированию

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, инновационный автоматизированный подход к анализу Глазодвигательный

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

В естественных послеродовой электропорации и Покадровый Визуализация из нейробласта миграции в Mouse острой мозга Ломтики

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

В естественных изображений зрительного нерва волокна целостность контрастным усилением МРТ у мышей

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Время-замедление конфокальной визуализации мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов мозга эмбриональной мыши с использованием<em&gt; В Утеро</em&gt; Электротовары

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Подготовка Ломтики свежих сетчатки от взрослых рыбок данио для Ex Vivo изображений эксперименты

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex-Utero Электропорация и Organotypic срез культуры мозги эмбриона мыши Live-образов миграции интернейронов ГАМК

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...