Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Financiación proporcionada por el Instituto Nacional del Ojo [5K08EY027850], Instituto Nacional de Salud y Desarrollo Infantil [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], y la Fundación de Oftalmología del Hospital Infantil [Faculty Discovery Award]. ECE es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Todo el trabajo de animales descrito aquí fue aprobado y realizado de conformidad con los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Boston Children's Hospital.
1. Apareras cronometradas
<ol><li>Colocar ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock No: 017952) ratones machos y hembras juntos durante la noche. Pesar las hembras y registrar pesos ant...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Este protocolo de cultivo de rebanadas ex vivo proporciona ventajas significativas sobre los ensayos de orientación de axón tradicionales23. El tamaño de cada núcleo motor craneal no es un factor limitante, y no es necesaria una disección difícil. Se mantiene el microambiente endógeno a través del cual viajan los axones, permitiendo la modificación de una vía de señalización manteniendo otras vías de señalización. Además, los efectos se pueden evaluar en diferentes puntos a lo larg...

El sistema de motor ocular proporciona un sistema elegante para investigar los mecanismos de orientación de axón. Es relativamente sencillo, que consiste en tres nervios craneales que inervian seis músculos extraoculares (EOM) que mueven el ojo, y el levator palpebrae superioris (LPS) que levanta el párpado. El nervio oculomotor incuba el LPS y cuatro EOM - el oblicuo inferior y los músculos medial, inferior, y superior recto. Los otros dos nervios, el trochlear y los abducens, cada uno de ellos sólo inervate un músculo, el músculo oblicuo superior y el músculo recto lateral, respectivamente. Los movimientos oculares proporcionan una lectura fácil, que muestra si la inervación era apropiada, faltaba o era aberrante. Además, hay trastornos del movimiento ocular humano que resultan de déficits en el desarrollo neuronal o guía de axón, colectivamente llamados los trastornos congénitos de disinnervación craneal (CCDD)1.
A pesar de estas ventajas, el sistema motor ocular rara vez se utiliza en los estudios de orientación de axón2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, debido a inconvenientes técnicos. Los ensayos de orientación axón in vitro tienen muchas desventajas11. Los ensayos de cocultivo, en los que los explantes neuronales se cultivan junto con explantas de tejido objetivo12 o células transfectóte13,dependen tanto de la simetría del explantar como del posicionamiento preciso entre el tejido explanteo y el tejido diana. Ensayos de rayas14,15, en los que se establecen dos señales en franjas alternas y los axones se evalúan para un crecimiento preferencial en una franja, sólo indican que un sustrato es preferible al otro, no que cualquiera de los dos sea atractivo repulsivo, o fisiológicamente relevante. Las cámaras de microfluidos pueden formar gradientes químicos precisos, pero sujeto a axones en crecimiento a tensión de cizallamiento16,17,18, que pueden afectar su crecimiento. Además, en cada uno de estos enfoques, la recolección de explantas o células disociadas requiere que los axons de crecimiento superior sean axotomizados y, por lo tanto, estos ensayos examinan realmente la regeneración de axón, en lugar del crecimiento inicial del axón. Por último, estos enfoques in vitro eliminan el microambiente que influye en los axones y sus respuestas a las señales a lo largo de diferentes puntos de su curso, y tradicionalmente sólo prueban una señal de forma aislada. Al componer estas desventajas, el pequeño tamaño de cada núcleo en el sistema motor ocular hace que la disección sea técnicamente difícil para explantas o cultivos disociados. Además, los cultivos primarios de las neuronas motoras oculares suelen ser heterogéneos, tienen muerte celular significativa y dependen de la densidad, lo que requiere la agrupación de células de múltiples embriones (Ryosuki Fujiki, comunicación personal). Los métodos in vivo, sin embargo, incluyendo modelos de ratón knockout, son inapropiados para su uso para la detección, dado el tiempo y los gastos requeridos.
Los métodos desarrollados para cultivar embriones enteros19 permiten el etiquetado de células migratorias20 o bloqueo de moléculas específicas21,pero los cultivos de embriones enteros requieren incubación en botellas de rodillos que impide la toma de imágenes en tiempo real de las etiquetas Estructuras. También son posibles las técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación del embrión y luego el posterior desarrollo posterior, ya sea en el útero o en el abdomen de la madre (manteniendo la conexión placentaria)22, pero tampoco permiten lapso de tiempo Imagen.
Para superar los obstáculos de los ensayos in vitro y permitir un cribado rápido de las vías de señalización, se desarrolló una técnica de cultivo de rodajas embrionarias ex vivo23,adaptada de un protocolo previamente publicado para el crecimiento del nervio periférico24. Usando este protocolo, el nervio oculomotor en desarrollo se puede imaginar con el tiempo en presencia de muchas de las estructuras circundantes a lo largo de su trayectoria, incluyendo objetivos de la MOE. Mediante la adición de inhibidores de moléculas pequeñas, factores de crecimiento o señales de orientación a los medios de cultivo, podemos evaluar perturbaciones de orientación en múltiples puntos a lo largo de la trayectoria del axón, permitiendo una evaluación más rápida del crecimiento potencial y los factores de orientación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Los movimientos oculares precisos son cruciales para la visión, pero el desarrollo del sistema motor ocular, especialmente las vías moleculares que controlan la orientación de axón, no ha sido completamente aclarado. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas de los ensayos tradicionales de orientación de axón. Para identificar señales adicionales de guía de axón que influyen en el nervio oculomotor, se desarrolló un ensayo de rebanada ex vivo para imaginar el nervio oculomotor en tiempo real a medida que crece hacia el ojo. E10.5 Los embriones IslMN-GFP se utilizan para generar rodajas ex vivo incrustándolas en agarosa, cortando en un vibratomo, luego creándolas en una incubadora de microscopio con fotomicroscopía de lapso de tiempo para 24-72 h. Rebanadas de control recapituladas el momento in vivo del crecimiento de los axónes desde el núcleo hasta la órbita. Se pueden añadir inhibidores de moléculas pequeñas o proteínas recombinantes a los medios de cultivo para evaluar el papel de las diferentes vías de orientación de axón. Este método tiene las ventajas de mantener más del microambiente local a través del cual atraviesan los axones, no axotomizar los axons en crecimiento, y evaluar los axons en múltiples puntos a lo largo de su trayectoria. También puede identificar efectos en subconjuntos específicos de axones. Por ejemplo, la inhibición de CXCR4 hace que los axones todavía dentro del cerebro medio crezcan dorsalmente en lugar de ventralmente, pero los axones que ya han salido ventralmente no se ven afectados.

Resultados normales: la figura 1 proporciona un esquema del experimento. A partir de e9.5 en ratón, los primeros axons comienzan a emerger del núcleo oculomotor26. Por E10.5, un nervio oculomotor fasciculado, que contiene las primeras neuronas pioneras, se puede ver en el mesenquima. Hay una variabilidad significativa entre los embriones en E10.5 (incluso dentro de la misma camada) en la distancia a la que el nervio ha progresado hacia la órbita, probablemente debi...

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Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Este protocolo nos permite identificar las vías de guía del axón activas en el nervio oculomotor y evaluar sus funciones en diferentes puntos a lo largo de la trayectoria nerviosa en tiempo real. Esta técnica preserva los entornos locales a través de los cuales viajan los axones y sus objetivos finales. Los axones en crecimiento no se cortan, por lo que se puede evaluar el crecimiento inicial del axón, en lugar de la regeneración.Este método proporciona información sobre la orientación del axón en el sistema motor ocular, pero podría adaptarse al estudio de la guía de axón de otros nervios. Esta técnica requiere práctica para dominar, y trabajar rápidamente es extremadamente importante. Al probarlo por primera vez, utilice sólo unos pocos embriones, en lugar de una camada entera.Antes de comenzar el procedimiento, primero confirme el embarazo por ultrasonido en el día embrionario 10.5 de un apareamiento cronolagado. Cosecha los embriones, rocía el abdomen del ratón embarazada con 70%etanol y usa tijeras para abrir la cavidad abdominal para extraer el útero. Lave el útero en una placa Petri de HBSS helado antes de colocar el órgano en un segundo plato petri de HBSS fresco helado.Bajo un alcance diseccionado, retire los embriones del cuerno uterino y sus sacos amnióticos individuales, colocando cada embrión en la parte inferior de la tapa de una placa de 12 pozos, sobre hielo, a medida que se cosechan. Utilice papel filtrante para eliminar cualquier líquido que rodea cada embrión, sin tocar los embriones ellos mismos, y sumerja los embriones en una agarosa líquida de baja fusión. Coloque la tapa de la placa sobre hielo para solidificar la agarosa.Cuando la agarosa se haya endurecido, voltee los embriones y cubra el otro lado de cada muestra con agarosa adicional. Cuando el segundo volumen de agarosa se haya solidificado, utilice un microscopio de disección de fluorescencia para recortar la agarosa alrededor de cada embrión de modo que cada embrión se oriente correctamente en la etapa del vibratoma. Los núcleos oculomotores y los primeros crecimientos de axones deben ser fluorescentes.Alinee cada embrión para que el núcleo, los axones que crecen y los ojos formen una línea, y utilice una cuchilla de afeitar para recortar la agarosa paralela a esta línea. A continuación, llene la cámara del vibratomo con el tampón de la rebanada helada, y supere el primer embrión a la etapa del vibratomo para que la hoja sea paralela con el núcleo oculomotor y los ojos. Cuando el superpegamento esté seco, sumerja la etapa del vibratoma para que el embrión esté orientado mirando hacia fuera de la hoja, y utilice una nueva hoja de vibratome para obtener rodajas de 400 a 450 micrómetros.Utilice una pipeta de transferencia estéril para transferir cada rebanada al tampón de corte en frío a medida que se adquiere, y utilice el microscopio de disección de fluorescencia para seleccionar la rebanada que contiene los núcleos y ojos oculomotores. Usando una pipeta de transferencia estéril, transfiera la rebanada a un inserto de cultivo celular en una placa de seis pozos que contenga 1,5 mililitros de medio de cultivo por pozo, y coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius. Retire la agarosa residual de la etapa del vibratoma, y supere el siguiente embrión al escenario, continuando recogiendo rodajas hasta que todos los embriones hayan sido seccionados y chapados.A continuación, añadir la concentración adecuada del inhibidor o molécula recombinante de interés, diluido en un disolvente adecuado, al medio de cada pozo. Cree una curva de dosis-respuesta. Imagen de las rodajas cada 30 minutos por contraste de fase y microscopía de fluorescencia durante un máximo de 72 horas.Durante el desarrollo normal en el útero, los primeros axones oculomotores de proteína fluorescente verde alcanzan la órbita por día embrionario 11.5 antes de ramificarse a sus objetivos finales, como se observa en este cultivo representativo de la rebanada. La orientación de la rebanada en la etapa del vibratoma es crucial, ya que las rebanadas no son interpretables si no están orientadas correctamente. Por ejemplo, si el embrión está inclinado hacia su lado, solo se observará un núcleo oculomotor dentro de la rebanada.Si el embrión incrustado está inclinado demasiado hacia su espalda, los ojos no estarán presentes dentro de la rebanada, y en su lugar se puede incluir la extremidad superior y el cerebro trasero o la médula espinal. También es importante tener cuidado de que durante la colocación de la rebanada en la membrana de cultivo, que el tejido no se doble. Tenga cuidado al disolver los inhibidores y factores de crecimiento en disolventes orgánicos.Por ejemplo, en este experimento, la rebanada murió después de la adición de etanol al medio. Recuerde mantener todo sobre hielo y minimizar el tiempo entre la extracción de los embriones y la colocación de las rodajas en la incubadora. Usando esta técnica, hemos comenzado a identificar mecanismos adicionales de guía de axón en el trabajo en el sistema motor ocular.Recuerde tener cuidado al trabajar con cuchillas de afeitar y que algunos inhibidores pueden ser peligrosos y deben manipularse cuidadosamente de acuerdo con sus perfiles de seguridad.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Investigación

Neurociencias

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

VisualEyes: Un sistema de software modular para experimentación oculomotor

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, un enfoque innovador para el análisis automatizado oculomotor

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparación frescas rebanadas retinales de pez cebra adulto para Ex Vivo de experimentos

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...