Name: ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Finansiering som tillhandahålls av National Eye Institute [5K08EY027850], National Institute of Child Health and Development [U54HD090255], Harvard-vision klinisk vetenskapsman Development program [5K12EY016335], Tempelherreorden Eye Foundation [karriär starter Grant], och Children ' s Hospital oftalmologi Foundation [Faculty Discovery Award]. ECE är Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Alla djur arbete som beskrivs här godkändes och utfördes i enlighet med Boston Children ' s Hospital institutionella Animal Care och use Committee (IACUC) protokoll.
1. tidsinställda parningar
<ol><li>Place ISLmn: GFP (Holmen motor neuron grönt fluorescerande protein; MGI: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J Stock nr: 017952) manliga och kvinnliga möss tillsammans över natten. Väg honor och rekord vikter före parning. Obs: <e...

<ol>
	<li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+(CCDDs):+insights+into+axon+growth+and+guidance.">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li><li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins.">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections.">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li><li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles.">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling.">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li><li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics,+kinesin+interactions,+and+axon+guidance.">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit/Robo+repulsion+and+Netrin/DCC+attraction.">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li><li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling.">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li><li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection.">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li><li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin.">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li><li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches.">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li><li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia.">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li><li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro.">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li><li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons.">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li><li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells.">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li><li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture.">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li><li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems.">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li><li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tangential+migration+in+neocortical+development.">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li><li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells.">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li><li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain.">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).</li><li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos.">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li><li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CXCR4/CXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis.">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li><li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth.">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).</li><li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics.">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li><li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain.">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li><li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle.">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li><li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay.">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li><li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+axon+guidance:+are+we+nearly+there+yet.">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li></ol>

Detta ex vivo slice kultur protokoll ger betydande fördelar jämfört med traditionella Axon väglednings analyser23. Storleken på varje kranialmotorisk kärna är inte en begränsande faktor, och ingen svår dissektion är nödvändig. Den endogena mikromiljön genom vilken axonerna färdas bibehålls, vilket möjliggör modifiering av en signalväg samtidigt som andra signaleringsvägar bibehålls. Dessutom kan effekter bedömas vid olika tidpunkter längs Axon-banan. Eftersom Axon vägledning...

Det okulära motorsystemet ger ett elegant system för att undersöka Axon vägledningssystem. Det är relativt okomplicerat, bestående av tre kraniala nerver innervating sex extraokulära muskler (EOMs) som flyttar ögat, och levator palpebraesuperior superioris (LPS) som lyfter ögonlocket. Den ögonmuskelförlamningar nerv innerverar LPS och fyra eoms-sämre sned och den mediala, sämre och överlägsen rectus muskler. De andra två nerver, den trochlear och abducens, var enda innerverar en muskel, den överlägsna sneda och laterala rectus muskler, respektive. Ögonrörelser ger en lätt avläsning, visar om innervation var lämpligt, saknas, eller avvikande. Dessutom, det finns mänskliga ögat rörelsestörningar som beror på underskott i neuronala utveckling eller Axon vägledning, kollektivt kallas den medfödda kraniala desinnervation störningar (CCDDs)1.
Trots dessa fördelar används okulärt motorsystem sällan i Axon väglednings studier2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, på grund av tekniska nackdelar. In vitro Axon väglednings analyser har många nackdelar11. Co-Culture analyser, där neuronala djur odlas tillsammans med djur av målvävnad12 eller transfekterade celler13, bero på både symmetri explantat och exakt positionering mellan explantat och målvävnad. Stripe-analyser14,15, där två ledtrådar är fastställda i alternerande ränder och axoner bedöms för preferens tillväxt på en rand, endast ange att ett substrat är att föredra framför den andra, inte att antingen är attraktiv eller repulsive, eller fysiologiskt relevanta. Mikrofluidik kammare kan bilda exakta kemiska gradienter, men ämne växande axoner till skjuvning stress16,17,18, vilket kan påverka deras tillväxt. Dessutom, i var och en av dessa metoder, samla in djur eller dissocierade celler kräver att outgrowing axoner vara axotomized och därmed dessa analyser faktiskt undersöka Axon förnyelse, snarare än initial Axon utväxt. Slutligen, dessa in vitro-metoder bort mikromiljön som påverkar axoner och deras svar på ledtrådar längs olika punkter i deras kurs, och traditionellt bara testa en cue i isolering. Compounding dessa nackdelar, gör den lilla storleken på varje kärna i den okulära motorsystemet dissektion tekniskt utmanande för antingen djur eller dissocierade kulturer. Dessutom, primära kulturer av okulära motoriska nervceller är vanligtvis heterogena, har betydande celldöd, och är densitet beroende, kräver sammanslagning av celler från flera embryon (Ryosuki Fujiki, personlig kommunikation). In vivo metoder, men inklusive knockout musmodeller, är olämpliga att använda för screening, med tanke på den tid och kostnader som krävs.
Metoder som utvecklats för att odla hela embryon19 Tillåt märkning av flyttande celler20 eller blockad av specifika molekyler21, men hela embryokulturer kräver inkubering i rullflaskor som utesluter realtids avbildning av märkta Strukturer. Kirurgiska tekniker som möjliggör manipulation av embryot och sedan senare vidareutveckling antingen i livmodern eller i buken av mamman (upprätthålla placenta anslutning)22 är också möjliga, men dessa inte heller tillåter tidsfördröjning Imaging.
För att övervinna hindren för in vitro-analyser och möjliggöra snabb screening av signalering vägar, en ex vivo embryonal slice kultur teknik utvecklades23, anpassad från ett tidigare publicerat protokoll för perifer nervutväxt24. Med hjälp av detta protokoll, utveckla ögon muskel nerven kan avbildas över tid i närvaro av många av de omgivande strukturerna längs dess bana, inklusive EOM mål. Genom att lägga till små molekyler hämmare, tillväxtfaktorer, eller vägledning signaler till kulturen media, kan vi bedöma vägledning störningar på flera punkter längs Axon bana, vilket möjliggör en snabbare bedömning av potentiella tillväxt och väglednings faktorer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1196px;" width="1196">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">24-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:163px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:344px;">25-107</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">6-Well Tissue Culture Plate</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-105</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-200</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11412-11</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fluorobrite DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose (200 g/L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2494001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14175-095</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11550H</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES Buffer Solution (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Glutamine (250 nM)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030081</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Loctite Superglue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16520050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>PICM03050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Moria Mini Perforated Spoon</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122&#160;</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri Dish (100 x 15mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Razor Blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surgical Scissors - Blunt</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14000-12</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome (VT 1200S)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>1491200S001</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>121-6</td>
			<td style="width:331px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo oculomotor slice culture from embryonic gfp-expressing mice for time-lapse imaging of oculomotor nerve outgrowth

Noggranna ögonrörelser är avgörande för synen, men utvecklingen av det okulära motorsystemet, särskilt de molekylära vägar som styr Axon-vägledningen, har inte helt klarlagts. Detta beror delvis på tekniska begränsningar av traditionella Axon väglednings analyser. För att identifiera ytterligare Axon vägledning signaler som påverkar ögon muskelmage, en ex vivo slice-analys för att avbilda den ögonmuskelförlamningar nerv i realtid som den växer mot ögat utvecklades. E 10.5 ISLmn-GFP embryon används för att generera ex vivo skivor genom att bädda in dem i aguppstod, skivning på en vibratome, sedan odla dem i ett Mikroskop skede-Top inkubator med tidsfördröjning photomicroscopy för 24-72 h. återför kontroll skivor recapitulate in vivo tidpunkten för utväxt av axoner från kärnan till omloppsbanan. Småmolekylära hämmare eller rekombinanta proteiner kan läggas till i kulturmedia för att bedöma vilken roll olika Axon väglednings vägar har. Denna metod har fördelarna med att upprätthålla mer av den lokala mikromiljön genom vilken axoner Traverse, inte axotomizing den växande axoner, och bedöma axonerna på flera punkter längs deras bana. Det kan också identifiera effekter på specifika undergrupper av axoner. Till exempel, hämning av CXCR4 orsakar axoner fortfarande inom mellanhjärnan att växa dorsalt snarare än ventralt, men axoner som redan har lämnat ventralt påverkas inte.

Normala resultat: figur 1 ger ett schematiskt experiment. Börjar så tidigt som e 9.5 i mus, de första axonerna börjar dyka upp från ögonmuskelförlamningar Nucleus26. Genom e 10.5, en fasciokulerade ögonmuskelförlamningar nerv, som innehåller de tidiga pionjär nervceller, kan ses i Mesenchyme. Det finns betydande variation mellan embryon vid E 10.5 (även inom samma kull) i hur långt nerven har framskridit mot omloppsbana, sannolikt på grund av utvecklings...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth at JoVE.com

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

En ex vivo slice-analys kan ögonmuskelförlamningar nerv utväxt att avbildas i realtid. Skivor genereras genom att bädda in E 10.5 ISLmn: GFP embryon i aguppstod, skivning på en vibratome, och växer i en scen-Top inkubator. Rollen för Axon väglednings vägar bedöms genom att lägga till hämmare till kulturen media.

Ex vivo Oculomotor slice kultur från embryonala GFP-uttrycker möss för tidsförlopp avbildning av Oculomotor nerv utväxt

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Detta protokoll tillåter oss att identifiera axonvägsvägar som är aktiva i den oculomotoriska nerven och att bedöma deras roller på olika punkter längs nervbanan i realtid. Denna teknik bevarar de lokala miljöer genom vilka axoner reser och deras slutliga mål. De växande axoner skärs inte, så inledande axon utväxt, snarare än förnyelse, kan bedömas.Denna metod ger insikter om axon vägledning i det okulär motoriska systemet men skulle kunna anpassas till studiet av axon vägledning av andra nerver. Denna teknik tar övning för att bemästra, och att arbeta snabbt är oerhört viktigt. När du försöker det för första gången, använd bara några embryon, snarare än en hel kull.Innan du börjar förfarandet, först bekräfta graviditeten genom ultraljud på embryonala dag 10,5 från en tidsansed parning. Skörda embryona, spraya buken av den gravida musen med 70%etanol, och använd sax för att öppna bukhålan för att extrahera livmodern. Tvätta livmodern i en petriskål av iskall HBSS innan du placerar orgeln i en andra petriskål av färsk iskall HBSS.Under en dissekering omfattning, ta bort embryon från livmoderhornet och deras individuella fosterhinnan säckar, placera varje embryo på undersidan av locket på en 12-brunns tallrik, på is, eftersom de skördas. Använd filterpapper för att avlägsna vätska som omger varje embryo, utan att röra embryona själva, och dränka embryona i flytande 4%lågsmältnings uppstod. Placera tallrikslocket på is för att stelna agarosen.När agarosen har härdat, vänd över embryona och täck över andra sidan av varje prov med ytterligare agaros. När den andra volymen av agaros har stelnat, använd en fluorescens dissekera mikroskop för att trimma agaros runt varje embryo så att varje embryo kommer att vara orienterad ordentligt på vibratome scenen. De oculomotoriska atomkärnorna och tidiga axon utväxt bör fluorescerande.Anpassa varje embryo så att kärnan, outgrowing axoner och öga bildar en linje, och använda ett rakblad för att trimma uppstod parallellt med denna linje. Fyll sedan vibratomkammaren med iskall skiva buffert, och superlimue det första embryot till vibratome scenen så att bladet kommer att vara parallellt med oculomotor kärnan och ögonen. När superlimmen är torr, dränka vibratome scenen så att embryot är orienterad vänd bort från bladet, och använda en ny vibratome blad för att få 400-till 450-mikrometer skivor.Använd en steril överföringspipett för att överföra varje skiva till kall skivningsbuffert när den förvärvas, och använd fluorescens dissekerande mikroskop för att välja den skiva som innehåller de oculomotoriska atomkärnorna och ögonen. Med hjälp av en steril överföringspipett överför du skivan på en cellodlingsinsats i en sex-brunnsplatta som innehåller 1,5 milliliter odlingsmedium per brunn, och placera plattan i en 37-graders Celsius-inkubator. Ta bort den kvarstående agaros från vibratome scenen, och superlim nästa embryo på scenen, fortsätter att samla skivor tills alla embryon har varit sektionerade och pläterade.Tillsätt sedan lämplig koncentration av hämmaren eller rekombinant molekyl av intresse, utspädd i ett lämpligt lösningsmedel, till medlet av varje brunn. Skapa en dos-responskurva. Bild skivorna var 30 minuter i fas kontrast och fluorescensmikroskopi i upp till 72 timmar.Under normal in utero utveckling, den första gröna fluorescerande protein-positiva oculomotor axoner når omloppsbanan av embryonala dag 11,5 innan förgrening till sina slutliga mål, som observerats i denna representativa skiva kultur. Orienteringen av segmentet på vibratome scenen är avgörande, eftersom skivorna inte är tolkningsbara om de inte är orienterade ordentligt. Till exempel, om embryot lutas åt sin sida, kommer endast en oculomotorisk kärna att observeras inom segmentet.Om det inbäddade embryot lutas för långt mot ryggen, kommer ögonen inte att finnas i segmentet, och i stället kan den övre delen och hindbrain eller ryggmärgen inkluderas. Det är också viktigt att ta hand om att under placeringen av skiva på odlingsmembranet, att vävnaden inte blir vikt. Var försiktig vid upplösning av hämmarna och tillväxtfaktorerna i organiska lösningsmedel.Till exempel i detta experiment, skiva dog efter tillsats av etanol till mediet. Kom ihåg att hålla allt på is och för att minimera tiden mellan extraktionen av embryona och att placera skivorna i inkubatorn. Med hjälp av denna teknik har vi börjat identifiera ytterligare axonvägningsmekanismer i arbetet i det okulärmotoriska systemet.Kom ihåg att vara försiktig när du arbetar med rakblad och att vissa hämmare kan vara farliga och bör hanteras försiktigt enligt deras säkerhetsprofiler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

Organotypic Slice Kultur av GFP-uttryckande musembryon i realtid avbildning av perifera nerver utväxt

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

En Organotypic Slice-analys för högupplöst Time-lapse avbildning av neuronala migration i Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

VisualEyes: A Modular Software System for Oculomotor Experimentation

Visualeyes: En modulär mjukvarusystem för oculomotor Experiment

Eye movement studies have provided a strong foundation forming an understanding of how the brain acquires visual information in both the normal and ...

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

VisioTracker, ett innovativt automatiserat strategi för ögonmuskelförlamningar analys

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

Motorisk nerv transection och Time-lapse avbildning av stödjeceller Beteenden Live Zebrafish

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

In vivo Postnatal elektroporation och Time-lapse avbildning av neuroblast migration i mus Akut hjärnan skivor

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

In vivo avbildning av Optic Nerve Fiber Integrity genom Contrast-Enhanced MRI hos möss

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse-konfokalbildning av migrerande neuroner i organotypisk skivkultur av embryonalt mushinne<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments

Förbereda färska Retinal skivor från vuxna zebrafiskar för Ex Vivo Imaging experiment

The retina is a complex tissue that initiates and integrates the first steps of vision. Dysfunction of retinal cells is a hallmark of many blinding ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Elektroporation och Organotypic skiva kulturer av embryonala mus hjärnor för Live-Imaging av migrera GABAergic interneuroner

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...