Name: identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المعاهد القومية للصحة GM120209 (GS). يشكر المؤلفون ال [أوسوك] [جنوميكس] [كر] موارد مقدّمة لخدماته ([كّك] دعم منحة [نك] [ك] [ب30] [ك16058]).

1. إنشاء خطوط الخلية HEK293 مستقرة التعبير عن التتراسيكلين inducible العلم الموسومة بروتين الفائدة (POI)
<ol><li>خلايا البذور HEK293 مع موقع إعادة تركيب فلب متكامل بشكل ملحوظ (FRT) في كثافة 10 × 104 خلايا / مل في متوسط النمو (دولبكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] + 10٪ مصل البقر الجنيني [FBS] + 1٪ البنسلين-ستربتوميس?...

<ol>
	<li>Karousis, E. D., Nasif, S., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact.">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li><li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+UPF1,+eRFs,+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways.">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li><li>Papasaikas, P., Valc&#225;rcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spliceosome:+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor.">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li><li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins.">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).</li><li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins.">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution.">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(iCLIP)+to+Determine+Protein-RNA+Interactions.">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li><li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome&#8208;wide+protein-RNA+interactions.">Advances and challenges in the detection of transcriptome&#8208;wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li><li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus.">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li><li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPiT-Seq:+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA:protein+complexes.">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li><li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity.">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li><li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM.">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li><li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm.">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li><li>Z&#252;nd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3'+UTRs.">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li><li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing.">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li><li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments.">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).</li><li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase.">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs.">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li><li>Giudice, G., S&#225;nchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs.">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPmap:+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins.">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).</li><li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements.">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li></ol>

نناقش هنا بعض الاعتبارات الرئيسية لتنفيذ RIPiT بنجاح. وقبل كل شيء، يجب تحسين الخطوات التقديمية الفردية لتحقيق أعلى كفاءة ممكنة في كل خطوة. وقد ثبت أن كمية الخرز agarose FLAG لعدد المدخلات من الخلايا الموصوفة هنا لتكون قوية لمجموعة واسعة من البروتينات التي اختبرناها. كما أن جزءا صغيرا فقط من البرو?...

داخل الخلايا، يوجد الحمض النووي الريبي في مجمع مع البروتينات لتشكيل RNA: مجمعات البروتين (RNPs). يتم تجميع RNPs حول البروتينات الملزمة RNA (RBPs، تلك التي تربط مباشرة RNA) ولكن أيضا تتألف من غير RBPs (تلك التي تربط RBPs ولكن ليس RNA)، وغالبا ما تكون ديناميكية في الطبيعة. وتعمل الممارسات التجارية التقييدية وعواملها المساعدة بصورة جماعية في إطار الممارسات التجارية الوطنية من أجل تنفيذ الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، في مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي (NMD) الذي يتم التوصل إلى هذا التسوس بوساطة هراء، تعترف بروتينات UPF (UPF1 وUPF2 وUPF3b) بالريبوسوم المنهي قبل الأوان. كل من البروتينات UPF يمكن ربط الحمض النووي الريبي، ولكن فقط عندما تجمع معا أن مجمع NMD نشط يبدأ في تشكيل. داخل هذا المجمع، يتم تنشيط UPF1 بشكل أكبر عن طريق الفسفورية من قبل SMG1 غير RBP، ومثل هذا التنشيط UPF1 يؤدي في نهاية المطاف إلى توظيف العوامل المسببة للاضمحلال mRNA1،2. وفي هذا المثال، تتطلب الممارسات التجارية التقييدية عوامل مساعدة غير من الممارسات التجارية التقييدية للتوظيف وتفعيل مجمع RNP الذي يؤدي إلى إجراء النُفِّم الوطني. ومع ذلك، فإن الخاصية الأخرى للـ RNPs هي عدم تجانسها التركيبي. النظر في spliceosome، الذي يوجد في المجمعات E أو A أو B أو C متميزة. المجمعات spliceosome مختلفة لديها البروتينات المتداخلة ومتميزة3. لدراسة وظائف RNP، من المهم توضيح أي RNAs ملزمة بالممارسات التجارية التقييدية والبروتينات المرتبطة بها. توجد العديد من الطرق لتحقيق ذلك، معكل نهج له مزاياه المميزة وعيوبه 4،5،6،7.
تعتمد الطرق الشائعة على نطاق واسع لتحديد مواقع ربط RBP — الربط المتبادل متبوعاً بالترسيب المناعي (CLIP) واختلافاته المختلفة - على الأشعة فوق البنفسجية (UV) للربط بين RBP وRNA8. غير أن هذا ليس نهجاً فعالاً للممارسات التجارية غير القائمة على النتائج في إطار الممارسات RNPs، التي لا تتصل مباشرة بالحمض النووي الريبي. وهنا، نوصف نهجاً بديلاً ينطبق على الممارسات التجارية التقييدية وغير الممارسات التجارية التقييدية على حد سواء، لعزل وتحديد مواقعها الملزمة بالحمض النووي الريبي. هذا النهج يسمى الحمض النووي الريبي المناعيالتر جنبا إلى جنب (RIPiT) يتكون من خطوتين منالي مناعي، والتي تساعد على تحقيق خصوصية أعلى بالمقارنة مع تنقية واحدة (الشكل 1)9،10. كما يمكن تنفيذ خطوات الترسيب المناعي الفردي (IP) في سلسلة أقل بالمقارنة مع CLIP، RIPiT لا يعتمد على توافر الأجسام المضادة التي يمكن أن تصمد أمام وجود المنظفات القوية أثناء الترسيب المناعي. الميزة الأكثر تفردا من RIPiT هو القدرة على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في خطوتين تنقية; وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مجمع RNP متميزة تركيبيا من المجمعات المماثلة الأخرى11.
ويمكن للاختلافات الصغيرة في إجراء RIPiT أن تزيد من تعزيز إثراء RNP. على سبيل المثال، بعض تفاعلات الحمض النووي الريبي أو البروتين ية داخل RNPs عابرة وقد يكون من الصعب تنقية آثار أقدام مثل هذه المجمعات بكفاءة. لتثبيت هذه التفاعلات، يمكن ربط RNPs داخل الخلايا مع الفورمالديهايد قبل تحلل الخلايا وRIPiT. على سبيل المثال، لاحظنا أن التفاعل الضعيف بين عامل مجمع تقاطع exon (EJC) الأساسي، EIF4AIII وعامل التفكيك EJC، يمكن تثبيت PYM12 مع علاج الفورمالديهايد بحيث يتم إثراء المزيد من آثار الحمض النووي الريبي (البيانات لا يظهر). قبل حصاد الخلايا وRIPiT، يمكن أيضا أن تعامل الخلايا مع الأدوية لتحقيق الاستقرار أو إثراء RNPs في دولة معينة. على سبيل المثال، عند دراسة البروتينات التي تتم إزالتها من mRNA أثناء الترجمة (على سبيل المثال، EJC13، UPF114)، يمكن أن يؤدي العلاج مع مثبطات الترجمة مثل البوروميدسين أو السيكلوهيكسميد أو الهارينغتونين إلى زيادة شغل البروتينات على RNAs.
كمية الحمض النووي الريبي المستردة من RIPiT عادة ما تكون منخفضة (0.5-10 pmoles، أي 10-250 نانوغرام RNA النظر في متوسط طول RNA من 75 nt). السبب الرئيسي لهذا هو أن جزءا صغيرا فقط من بروتين معين موجود في مجمع مع البروتينات الأخرى داخل RNPs (يتم فقدان أي "حر" البروتين IP'ed في الخطوة الأولى خلال IP الثاني). لتوليد مكتبات RNA-Seq من هذا RNA، ونحن أيضا الخطوط العريضة هنا التكيف من بروتوكول نشرت سابقا مناسبة لمثل هذه المدخلات RNA منخفضة15،16 (الشكل2)، والتي تسفر عن عالية الإنتاجية تسلسل عينات جاهزة في 3 ايام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Anti-FLAG Affinity Gel</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ATP, [&#947;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250&#181;Ci</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:101px;">BLU502A250UC</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Betaine 5M</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B0300</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">biotin-dATP</td>
			<td style="width:112px;">TriLink</td>
			<td style="width:101px;">N-5002</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">biotin-dCTP</td>
			<td style="width:112px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEL540001EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Branson Sonifier, Model SSE-1</td>
			<td style="width:112px;">Branson</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CircLigase I</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">76081-606</td>
			<td style="width:591px;">ssDNA ligase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">11995-065</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DNA load buffer NEB</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Dynabeads Protein A</td>
			<td style="width:112px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">10002D</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">R78007</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">GeneRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:101px;">FERSM1203</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:101px;">10687010</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4565013</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4566033</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRCAT-33 adapter 5&#8242;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mirus transIT-X2 transfection reagent</td>
			<td style="width:112px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 6004</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mth RNA ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2610S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE1.0 5&#8242;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT 
			CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE2.0 5&#8242;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC 
			GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:101px;">BP1752I-100</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Purple Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">NEB #7025</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Q5 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0491S/L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:363px;">RNase I, E. coli, 1000 units</td>
			<td style="width:112px;">Eppicenter</td>
			<td style="width:101px;">N6901K</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">SPIN-X column</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160-24EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Streptavidin beads</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">60210</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Superscript III (SSIII)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">18080044</td>
			<td style="width:591px;">reverse transcriptase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SybrGold</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S11494</td>
			<td style="width:591px;">gold nucleic acid gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:363px;">T4 Polynucleotide Kinase-2500U</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0201L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">T4RNL2 Tr. K227Q</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:101px;">87128</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Thermostable 5&#180; App DNA/RNA Ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0319S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE1 5&#8242;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE10 5&#8242;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE11 5&#8242;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA 
			GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE12 5&#8242;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE2 5&#8242;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE35&#8242;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE4 5&#8242;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE5 5&#8242;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE6 5&#8242;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE7 5&#8242;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT 
			TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE8 5&#8242;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT 
			CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE9 5&#8242;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Typhoon 5 Bimolecular Imager</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td align="right" style="width:101px;">29187191</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)

الحمض النووي الريبي المناعي الترسيب جنبا إلى جنب (RIPiT) هو وسيلة لإثراء آثار أقدام الحمض النووي الريبي من زوج من البروتينات داخل RNA: البروتين (RNP) مجمع. يستخدم RIPiT خطوتين تنقية. أولاً، يتبع الترسيب المناعي لوحدة فرعية RNP الموسومة هضم RNase معتدل وما يترتب على ذلك من عدم التنافر تقارب الإنحطاط. يسمح هطول الأمطار المناعي الثاني لوحدة فرعية أخرى RNP بإثراء مركب محدد. بعد إزالة التناطور من RNAs والبروتينات، يتم تحويل آثار أقدام الحمض النووي الريبي إلى مكتبات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية. على عكس الأشعة فوق البنفسجية الأكثر شعبية (UV) الربط المتصالب تليها المناعيةالتر (CLIP) نهج لإثراء مواقع الربط RBP، RIPiT هو الأشعة فوق البنفسجية crosslinking مستقلة. وبالتالي RIPiT يمكن تطبيقها على العديد من البروتينات الموجودة في interactome RNA وخارجها التي هي ضرورية لتنظيم RNA ولكن لا تتصل مباشرة الحمض النووي الريبي أو الأشعة فوق البنفسجية كروسلينك سيئة إلى RNA. توفر خطوتا التنقية في RIPiT ميزة إضافية لتحديد المواقع الملزمة التي يعمل فيها بروتين الاهتمام بالشراكة مع عامل مساعد آخر. كما تعمل استراتيجية التنقية المزدوجة على تعزيز الإشارة عن طريق الحد من الخلفية. هنا، نحن نقدم إجراء خطوة حكيمة لأداء RIPiT وتوليد مكتبات تسلسل عالية الإنتاجية من آثار أقدام RNA معزولة. كما نلخص مزايا وتطبيقات RIPiT ونناقش بعض قيودها.

وسيؤدي نجاح RIPiT إلى هطول الأمطار المناعية لكل من البروتينات ذات الأهمية وغيرها من البروتينات المعروفة المتفاعلة، وعدم وجود بروتينات غير متفاعلة. وكما هو مُرى في الشكل 3ألف،تم الكشف عن كل من ماغوه وEIF4AIII في الإلتليل RIPiT، ولكن HNRNPA1 لم يكن (الممر 6). وبالتوازي مع ذلك، تم...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو "آثار أقدام" من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

رنا المناعة جنبا إلى جنب متبوعا بالتسلسل، أو RIPiT-Seq، هو وسيلة لتحديد ما هي المناطق من الجيش الملكي النيبالي ملزمة بزوج معين من البروتينات ملزمة RNA. الميزة الأكثر فريدة من RIPiT هو قدرته على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في تنقية اثنين. وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مركب بروتين الحمض النووي الريبي متميز من المجمعات الأخرى.أيضا، RIPiT-Seq هو UV crosslinking مستقلة، ويمكن تطبيقها على العديد من البروتينات التي تعمل على RNA دون ربط مباشرة. في حين أن هذه الطريقة لا تمتد مباشرة نحو العلاج أو التشخيص، وقد ارتبطت البروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة ومعالجة الحمض النووي الريبي مع العديد من الأمراض مثل اعتلال الأعصاب والسرطان. RIPiT-Seq يوفر أداة لدراسة وظائف البروتينات المرتبطة بالأمراض الحمض النووي الريبي ملزمة.RIPiT-Seq يتطلب نظام حيث يمكن التعبير عن البروتين الموسومة epitope. وقد تم اختباره فقط في خلايا HEK293، وهو الأكثر قابلية لثقافة الخلية. ومع ذلك، الآن مع قدرتنا على وضع علامة على البروتينات باستخدام CRISPR، RIPiT-Seq يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على النظم الحديثة المتنوعة.يعتمد نجاح RIPiT على اثنين من الاعوداد المناعية الفعالة ، لذلك سيكون من الضروري تحسين ظروف المناعة للجسم المضاد المستخدم. أيضا، العمل مع الجيش الملكي النيبالي يتطلب الاحتياطات المناسبة، لذلك ينبغي استخدام الكواشف الخالية من RNase أثناء وبعد استخراج الحمض النووي الريبي. إثبات الإجراء سيكون لورين وودوارد، طالبة دراسات عليا في مختبري.ابدأ بغسل الخلايا أحادية الطبقة بلطف مع 15 ملليلتر من PBS المبردة لكل لوحة 15 سنتيمترًا. ثم كشط من الخلايا إلى 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني وجمعها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، والتخلص من supernatant.إضافة أربعة ملليلترات من الجليد الباردة العازلة تحلل تحلل واستخدام ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا. نقل lysate إلى أنبوب خمسة ملليلتر واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. ضع الليسات في حمام جليدي و sonicate وفقًا لاتجاهات المخطوطات.ثم إضافة 108 ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس لضبط تركيز الملح إلى 150 ملليمولار. ثم، الطرد المركزي في 12،000 ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من عظمى لتحليل لطخة الغربية. قبل غسل الخرز العلم agarose وفقا لاتجاهات المخطوطات وتطبيق السوبر المتبقية إلى 750 ميكرولترات من الخرز في أنبوب خمسة ملليلتر.احتضان الخرز agarose العلم مع استخراج الخلية لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف. بعد الحضانة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي في 400 غرام لمدة دقيقة واحدة في أربع درجات مئوية، وجمع 20 ميكرولترات من ااغض لتحليل لطخة الغربية. تجاهل الماخرة المتبقية وغسل الخرز عن طريق resuspending لهم في أربعة ملليلتر من العازلة غسل ايزو.بيليه الخرز مرة أخرى وإزالة supernatant. تمييع RNase I في 750 ميكرولترات من مخزن الغسيل ISO وفقا لاتجاهات المخطوطات، وإضافته إلى الخرز agarose العلم. احتضان الخليط في أربع درجات مئوية مع خلط لطيف، ثم بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي.جمع 20 ميكرولترات من supernatant لتحليل البقعة الغربية ، وتجاهل بقية. ثم، وغسل الخرز مع تخزين غسيل ISO كما هو موضح سابقا. المقبل، أداء elution تقارب بإضافة 375 ميكرولترات من عازلة elution إلى الخرز، وهز الخليط بلطف في أربع درجات مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين.بعد الحضانة، بيليه الخرز وجمع 15 ميكرولتر aliquot من elution لتحليل لطخة الغربية. بينما هو جار elution تقارب، أداء الخرز المغناطيسي المضاد للجسم. تبدأ عن طريق غسل 50 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي في ملليلتر واحد من ايزو غسل العازلة.resuspend الخرز في 100 ميكرولترات من العازلة اقتران وإضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة. ثم، احتضان الخرز لمدة 10 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الخرز المغناطيسي مرتين مع العازلة اقتران وإعادة ربط الخرز في 375 ميكرولترات من العازلة التخفيف RIPiT.تخزين الخرز على الجليد حتى المناعة. تطبيق elution تقارب العلم إلى الخرز المغناطيسي المضادة- مقترنة واحتضان مع خلط لطيف لمدة ساعة إلى ساعتين في أربع درجات مئوية. التقاط الخرز المغناطيسي مع المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من عظمى لتحليل البقعة الغربية.ثم، وغسل الخرز سبع مرات مع تخزين غسيل ايزو. المضي قدما في denaturing elution عن طريق إعادة حبات المغناطيسي في 100 ميكرولترات من عازل عينة واضحة وتحتضن التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق. أثناء الاحتضان، نفض الغبار دوريا الخرز لإعادة تعليق لهم.التقاط الخرز المغناطيسي على المغناطيس وجمع 15 ميكرولترات من elution لتحليل البقعة الغربية. نقل elution المتبقية إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. لاستخراج الحمض النووي الريبي، إضافة 320 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase و 400 ميكرولترات من الكحول ايساميل الفينول الكلوروفورم إلى elution RIPiT.دوامة الخليط ومن ثم الطرد المركزي في 12،000 غرام لمدة خمس دقائق. جمع 350 ميكرولترات من المرحلة مائي في أنبوب منفصل. إضافة خلات الصوديوم، كلوريد المغنيسيوم، الجليكوجين، والإيثانول إلى العينة التي تم جمعها وتحتضن الخليط بين عشية وضحاها في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية.في اليوم التالي, بيليه الجيش الملكي النيبالي من قبل الطرد المركزي في 12, 000 غرام لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية وغسلها في 70٪ الإيثانول. بعد غسل الإيثانول، تعامل مع الحمض النووي الريبي T4 مع كيناز متعدد النوى، أو PNK، دون أي ATP، وإجراء تنقية الفينول الكلوروفورم وفقا لاتجاهات المخطوطات. Resuspend RNA نظيفة في 4.5 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase.لتحديد العائد RNA، radiolabel الجيش الملكي النيبالي مع PNK و 32P المسمى ATPs وفقا لتوجيهات المخطوطات. استخدام سلم الحمض النووي المدى المنخفض و 20 إلى 40 نيوكليوتيدات الاصطناعية oligo لحجم وكمية المعايير. حل الحمض النووي الريبي المسمى على 26٪ من هلام اليوريا بولياكريلاميد.جفف الجل وفقًا لاتجاهات المخطوطة وتعرّض الجل إلى phosphoscreen حتى يتم اكتشاف إشارة كافية. وقد استخدمت هذه التقنية للتحقيق في التفاعلات بين مجمع مفرق إكسون أو EJC. تحليل البقعة الغربية من البروتينات تنقية من كل خطوة رئيسية في الإجراء RIPiT تبين أن EJC تنقية يحتوي على كل من EIF4A3 و MAGOH.لم يتم الكشف عن التحكم السلبي، HNRNPA1، في elution. قوة إشارة البصمة الرنا يرتبط مع كمية تفاعل البروتين RNA. لوحظ وجود بصمة أقوى عندما تم تنفيذ RIPiT على الخلايا المعالجة بالبوروميسين ، مما يزيد من إشغال EJC على الحمض النووي الريبي.لضمان أن RIPiT قد تم فعالة، من المهم لاختبار كفاءة الملكية الفكرية من قبل لطخة الغربية. من المهم أيضًا تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي قبل المضي في التسلسل العميق. في عام 2018 ، استخدم مختبر سينغ هذه التقنية بنجاح لتنقية نوعين من الاختلافات المتميزة من مجمع تقاطع exon وتحديد أنماط ربط الحمض النووي الريبي.إذا اختار الباحثون الكشف عن آثار الحمض النووي الريبي مع التصوير الذاتي، ينبغي اتباع جميع إجراءات السلامة الإشعاعية المناسبة والبروتوكولات.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

تسلسل وتحليل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من الجزر البنكرياسية البشرية

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

تحديد RNAs الدائري باستخدام تسلسل RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

تحويل جذر الطماطم متبوعاً بالتلقيح مع Ralstonia Solanacearum للتحليل الوراثي المباشر لمرض الذبول البكتيري

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

فحص وتحديد مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي من المؤثرات المفرزة من مسببات الأمراض النباتية

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

نسخ على نطاق التنميط من البروتين RNA التفاعلات من خلال ربط عبر والمناعة بوساطة العلم Biotin تنقية جنبا إلى جنب

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

اكتشاف الأهداف التنظيمية CsgD في السالمونيلا biofilm باستخدام كروماتين ايمونوبريسيبيتيشن والتسلسل عاليه الانتاجيه (رقاقه-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...