Name: identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי מענק NIH GM120209 (GS). המחברים מודים לליבה של משאבים משותפים גנומיקה של אוסוקCC עבור שירותיהם (מענק תמיכת CCC NCI P30 CA16058).

1. הקמת HEK293 אורווה קווים תאים הבעת טטרציקלין-inducible דגל-מתויג חלבון של עניין (פוי)
<ol><li>זרע HEK293 תאים עם משולב באופן בלתי נשכח Flp היעד (FRT) באתר בצפיפות של 10 x 104 תאים/mL בתווך הצמיחה (בינונית שונה של העיט של הנשר [dmem] + 10% סרום העוברי העובר [fbs] +1% פניצילין-סטרפטומיצין [פן/דלקת]) ב 6- צלחות. אפשר לתא?...

<ol>
	<li>Karousis, E. D., Nasif, S., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact.">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li><li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+UPF1,+eRFs,+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways.">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li><li>Papasaikas, P., Valc&#225;rcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spliceosome:+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor.">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li><li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins.">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).</li><li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins.">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution.">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(iCLIP)+to+Determine+Protein-RNA+Interactions.">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li><li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome&#8208;wide+protein-RNA+interactions.">Advances and challenges in the detection of transcriptome&#8208;wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li><li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus.">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li><li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPiT-Seq:+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA:protein+complexes.">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li><li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity.">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li><li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM.">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li><li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm.">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li><li>Z&#252;nd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3'+UTRs.">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li><li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing.">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li><li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments.">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).</li><li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase.">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs.">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li><li>Giudice, G., S&#225;nchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs.">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPmap:+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins.">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).</li><li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements.">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li></ol>

אנו דנים כאן כמה שיקולים מרכזיים כדי לבצע בהצלחה RIPiT. בראש ובראשונה, כתובות Ip בודדות חייבות להיות ממוטבות להשגת היעילות הגבוהה ביותר בכל שלב. כמות חרוזים הדגל העלה עבור מספר הקלט של תאים שתוארו כאן הוכיחה להיות חזקים עבור מגוון רחב של חלבונים שבדקנו. כמו רק חלק קטן של חלבונים שותפים הוא co-immu...

בתוך תאים, RNA קיים מורכב עם חלבונים כדי ליצור RNA: מכלולי חלבון (RNPs). RNPs מקובצים סביב ה-RNA כריכת חלבונים (Rnps, אלה אשר לאגד ישירות RNA) אבל גם מהווים ללא Rnps (אלה לאגד Rnps אך לא RNA), ולעתים קרובות דינמי בטבע. RBPs והקופדים שלהם פועלים באופן קולקטיבי בתוך Rbps כדי לבצע פעולות רגולטוריות. לדוגמה, ב-mRNA בתיווך שטויות (NMD) מסלול, החלבונים UPF (UPF1, UPF2, ו UPF3b) מזהים את ריבוכמה הסתיים בטרם עת. כל אחד מחלבונים UPF יכול לאגד RNA, אבל זה רק כאשר הם להרכיב יחד כי מורכבת NMD פעיל מתחיל להיווצר. בתוך מתחם זה, UPF1 מופעל עוד על ידי זירחון על ידי SMG1 שאינו rbp, והפעלת UPF1 כגון בסופו של דבר מובילה לגיוס של מקדם ריקבון mrna הגורם1,2. בדוגמה זו, RBPs דורש שחקנים שאינם מבוססי RBPS עבור גיוס והפעלה של מתחם RBPS המפעיל את NMD. מאפיין נוסף של RNPs הוא הטרוגניות שלהם. שקול את הספצאוחלק, אשר קיים ברורים E, A, B או C מתחמים. מתחמים שונים מתחמי יש לחפוף חלבונים ברורים3. כדי ללמוד פונקציות RNP, חשוב להבהיר אילו Rnp מאוגדים על ידי RNP ואת החלבונים המשויכים שלה. שיטות רבות קיימות כדי להשיג זאת, עם כל גישה יש יתרונות וחסרונות ברורים שלה4,5,6,7.
השיטות הנפוצות ביותר כדי לזהות אתרי כריכה RBP-הקישור ואחריו immunoprecipitation (קליפ) ואת הווריאציות השונות שלה-להסתמך על אולטרה סגול (UV) אור כדי crosslinking RBP ל-RNA8. עם זאת, זו אינה גישה אפקטיבית עבור non-RBPs בתוך Rbps, אשר אינם פונים אל RNA ישירות. כאן, אנו מתארים גישה חלופית הישימה ל-RBPs וללא RBPs כאחד, כדי לבודד ולזהות את אתרי איגוד ה-RNA שלהם. גישה זו נקראת RNA immunoprecipitation בטנדם (ripit) מורכב משני שלבים immunoprecipitation, אשר לעזור להשיג ספציפיות יותר לעומת טיהור אחד (איור 1)9,10. כפי שניתן לבצע את הצעדים הבודדים immunoprecipitation (IP) באופן מוגזם לעומת הקליפ, RIPiT אינו תלוי בזמינות של נוגדנים שיכולים לעמוד בפני נוכחות של חומרי ניקוי חזקים במהלך immunoprecipitation. היתרון הייחודי ביותר של RIPiT הוא היכולת למקד שני חלבונים שונים בשני שלבי טיהור; הדבר מספק דרך רבת-עוצמה להעשיר את מתחם ה-RNP שונה ומורכב מתסביכים דומים אחרים11.
וריאציות קטנות להליך RIPiT יכול לשפר עוד יותר את העשרה RNP. למשל, כמה אינטראקציות RNA-חלבון או חלבון-חלבון בתוך RNPs הם ארעי וזה עלול להיות קשה לטהר ביעילות את העקבות של תסביכים כאלה. כדי לייצב אינטראקציות כאלה, RNPs יכול להיות מקושר בתוך תאים עם פורמלדהיד לפני הליזה תא ו RIPiT. לדוגמה, ראינו כי אינטראקציה חלשה בין מורכבות הצומת אקסון (ejc) הליבה גורם, EIF4AIII וגורם פירוק ejc, pym12 ניתן לייצב עם טיפול פורמלדהיד כגון זה יותר העקבות RNA מועשרים (נתונים לא מוצג). לפני איסוף התא RIPiT, תאים יכולים גם להיות מטופלים עם תרופות כדי לייצב או להעשיר RNPs במצב מסוים. לדוגמה, כאשר לומדים חלבונים שהוסרו מ-mRNA במהלך התרגום (למשל, EJC13, UPF114), טיפול במעכבי תרגום כגון puromycin, cycloheximide או harringtonine יכול להוביל לאכלוס מוגבר של חלבונים ב-RNAs.
כמות ה-RNA ששוחזר מ-RIPiT נמוך בדרך כלל (0.5-10 שומות, כלומר, 10-250 ng RNA בהתחשב באורך RNA ממוצע של 75 nt). הסיבה העיקרית לכך היא כי רק חלק קטן של חלבון נתון קיים מורכב עם חלבונים אחרים בתוך RNPs (כל "חינם" החלבון IP'ed בשלב הראשון הוא איבד במהלך ה-IP השני). כדי לייצר ספריות rna-Seq מן ה-rna הזה, אנחנו גם מתווה כאן עיבוד של פרוטוקול שפורסם בעבר מתאים כגון RNA נמוך כגון15,16 (איור 2), אשר מניב את התפוקה הגבוהה ברצף מוכן דגימות של 3 ימים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Anti-FLAG Affinity Gel</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ATP, [&#947;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250&#181;Ci</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:101px;">BLU502A250UC</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Betaine 5M</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B0300</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">biotin-dATP</td>
			<td style="width:112px;">TriLink</td>
			<td style="width:101px;">N-5002</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">biotin-dCTP</td>
			<td style="width:112px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEL540001EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Branson Sonifier, Model SSE-1</td>
			<td style="width:112px;">Branson</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CircLigase I</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">76081-606</td>
			<td style="width:591px;">ssDNA ligase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">11995-065</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DNA load buffer NEB</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Dynabeads Protein A</td>
			<td style="width:112px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">10002D</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">R78007</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">GeneRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:101px;">FERSM1203</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:101px;">10687010</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4565013</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4566033</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRCAT-33 adapter 5&#8242;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mirus transIT-X2 transfection reagent</td>
			<td style="width:112px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 6004</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mth RNA ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2610S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE1.0 5&#8242;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT 
			CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE2.0 5&#8242;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC 
			GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:101px;">BP1752I-100</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Purple Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">NEB #7025</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Q5 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0491S/L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:363px;">RNase I, E. coli, 1000 units</td>
			<td style="width:112px;">Eppicenter</td>
			<td style="width:101px;">N6901K</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">SPIN-X column</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160-24EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Streptavidin beads</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">60210</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Superscript III (SSIII)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">18080044</td>
			<td style="width:591px;">reverse transcriptase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SybrGold</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S11494</td>
			<td style="width:591px;">gold nucleic acid gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:363px;">T4 Polynucleotide Kinase-2500U</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0201L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">T4RNL2 Tr. K227Q</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:101px;">87128</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Thermostable 5&#180; App DNA/RNA Ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0319S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE1 5&#8242;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE10 5&#8242;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE11 5&#8242;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA 
			GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE12 5&#8242;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE2 5&#8242;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE35&#8242;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE4 5&#8242;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE5 5&#8242;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE6 5&#8242;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE7 5&#8242;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT 
			TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE8 5&#8242;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT 
			CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE9 5&#8242;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Typhoon 5 Bimolecular Imager</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td align="right" style="width:101px;">29187191</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)

רנ א immunoprecipitation בטנדם (RIPiT) היא שיטה להעשרת עקבות RNA של שני החלבונים בתוך RNA: חלבון (RNP) קומפלקס. RIPiT מעסיקה שני צעדי טיהור. ראשית, immunoprecipitation של RNP מתויג משנה לאחר מכן העיכול מתון RNase ובעקבות הימנעות האהדה הבאה. הimmunoprecipitation השנייה של יחידת משנה RNP נוספת מאפשרת להעשיר מתחם מוגדר. בעקבות הימנעות של RNAs וחלבונים, עקבות ה-RNA מומרים לספריות רצפי DNA של תפוקה גבוהה. בניגוד לאולטרה סגול פופולרי (UV) החוצה קישור ואחריו immunoprecipitation (CLIP) גישה להעשיר RBP אתרי כריכה, RIPiT הוא UV-crosslinking עצמאי. מכאן RIPiT יכול להיות מיושם על חלבונים רבים הנמצאים ב-RNA interactome ומעבר כי הם חיוניים רגולציה RNA אבל לא ישירות ליצור קשר עם RNA או UV-crosslink גרוע RNA. שני צעדי הטיהור בריבור מספקים יתרון נוסף של זיהוי אתרי קשירה שבהם חלבון הריבית מתפקד בשותפות עם קופקטור אחר. אסטרטגיית הטיהור הכפולה משמשת גם להגברת האות באמצעות הגבלת הרקע. כאן, אנו מספקים הליך מבחינת צעד כדי לבצע RIPiT ולייצר התפוקה גבוהה ברצף ספריות מתוך עקבות RNA מבודדים. כמו כן, אנו מתווה את היתרונות והיישומים של RIPiT ודנים בחלק מהמגבלות שלה.

RIPiT מוצלח יביא את הimmunoprecipitation של שני החלבונים של הריבית ואת החלבונים אינטראקציה אחרים הידועים, ואת העדר חלבונים שאינם באינטראקציה. כפי שנראה באיור 3A, הן MAGOH ו EIF4AIII זוהו בשנת הללויה, אבל HNRNPA1 לא היה (ליין 6). במקביל, העקבות של RNA כי יש מטוהרים משותפת עם מכלולי RNP זוהה באמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

זיהוי של טביעות רגליים של RNA: מכלולי חלבון באמצעות RNA Immunoprecipitation בטנדם ואחריו רצף (RIPiT-Seq)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעשיר את אתרי ה-RNA האנדוגניים או "עקבות" של RNA: מכלולי חלבון (RNP) מתאי יונקים. גישה זו כוללת שני immunoprecipitations של RNP תת יחידות, ולכן המכונה RNA immunoprecipitation בטנדם (RIPiT).

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

RNA immunoprecipitation במשולב ואחריו רצף, או RIPiT-Seq, היא שיטה לזיהוי אילו אזורים של RNA מאוגדים על ידי זוג מסוים של חלבונים מחייבים RNA. היתרון הייחודי ביותר של RIPiT הוא היכולת שלה למקד שני חלבונים שונים בשני טיהורים. זה מספק דרך רבת עוצמה להעשיר עבור קומפלקס חלבון RNA ברור קומפוזיציה של קומפלקסים אחרים.כמו כן, RIPiT-Seq הוא עצמאי UV-crosslinking, והוא יכול להיות מיושם על חלבונים רבים לפעול על RNA מבלי לחייב אותו ישירות. בעוד שיטה זו אינה חלה ישירות לכיוון טיפול או אבחון, חלבונים מחייבים RNA ועיבוד RNA קושרו עם מספר מחלות כמו נוירופתיות וסרטן. RIPiT-Seq מספק כלי לחקר פונקציות של חלבונים מחייבים RNA הקשורים למחלות.RIPiT-Seq דורש מערכת שבה חלבון מתויג אפיטופ יכול להתבטא. הוא נבדק רק בתאי HEK293, והוא נוח ביותר לתרבות התאים. עם זאת, כעת עם היכולת שלנו לתייג חלבונים באמצעות CRISPR, RIPiT-Seq יכול להיות ישים למערכות מודרניות מגוונות.ההצלחה של RIPiT תלויה בשני immunoprecipitations יעיל, ולכן זה יהיה קריטי כדי לייעל את תנאי immunoprecipitation עבור הנוגדן בשימוש. כמו כן, עבודה עם RNA דורשת אמצעי זהירות נאותים, ולכן ריאגנטים ללא RNase יש להשתמש במהלך ואחרי מיצוי RNA. הפגנת ההליך תהיה לורן וודוורד, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי.התחל על ידי שטיפת תאים monolayer בעדינות עם 15 מיליליטר של PBS מקורר לכל צלחת 15 ס"מ. ואז לגרד את התאים לתוך 30 מיליליטר של PBS ולאסוף אותם בצינור חרוט 50 מיליליטר. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהשליך את העל טבעי.הוסף ארבעה מיליליטר של חיץ תות תותים היפוטוני קר כקרח ולהשתמש פיפטה P1000 כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים את הביסאט לצינור של חמישה מיליליטר ומדרגים על קרח למשך 10 דקות. מניחים את הlysate באמבט קרח ו sonicate על פי הוראות כתב היד.לאחר מכן מוסיפים 108 מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן כדי להתאים את ריכוז המלח ל 150 מילימולר. לאחר מכן, צנטריפוגה lysate ב 12, 000 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. טרום שטיפה FLAG agarose חרוזים על פי הוראות כתב היד ולהחיל על טבעי שנותרו 750 microliters של חרוזים בצינור חמישה מיליליטר.דגירה חרוזי דגל agarose עם תמצית התא במשך שעה עד שלוש שעות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 גרם במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס, ולאסוף 20 microliters של supernatant לניתוח כתם מערבי. השליכו את העל-טבעי הנותרים ושטפו את חרוזים על-ידי שימוש חוזר בהם בארבעה מיליליטר של חיץ שטיפת ISO.גלולה את חרוזים שוב ולהסיר את על טבעי. לדלל RNase אני ב 750 microliters של מאגר לשטוף iso על פי הוראות כתב יד, ולהוסיף אותו גם דגל agarose חרוזים. הדגירה את התערובת בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין, ולאחר מכן גלולה את חרוזים על ידי צנטריפוגה.לאסוף 20 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי, ולהשליך את השאר. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם מאגר לשטוף iso כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצעו אלוטיון אהדה על ידי הוספת 375 מיקרוליטרים של חיץ אלוטציה לחרוזים, וטלטלו את התערובת בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים.לאחר הדגירה, גלולה את חרוזים ולאסוף aliquot 15 microliter של elution לניתוח כתם מערבי. בזמן שאלוטיון הזיקה בעיצומו, בצעו התייחדות נוגדנים של חרוזים מגנטיים. התחל על ידי שטיפת 50 microliters של חרוזים מגנטיים במיליליטר אחד של חיץ שטיפת iso.תוסיפו את הצפרוזים ל-100 מיקרוליטרים של חיץ ההטיה ותוסיפו את הכמות המתאימה של נוגדנים. לאחר מכן, הדגירה את חרוזים לפחות 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את חרוזים מגנטיים פעמיים עם חיץ ההטיה ולחדש את חרוזים ב 375 microliters של מאגר דילול RIPiT.לאחסן את חרוזים על קרח עד immunoprecipitation. יש למרוח את אלוטת הזיקה של FLAG על חרוזים מגנטיים מקובצים בנוגדנים ולהדגירה עם ערבוב עדין למשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. ללכוד את חרוזים מגנטיים עם מגנט ולאסוף 15 microliters של על טבעי לניתוח כתם מערבי.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים שבע פעמים עם חיץ לשטוף iso. המשך עם elution denaturing על ידי שימוש חוזר חרוזים מגנטיים ב 100 microliters של חיץ מדגם ברור דגירה ההשעיה על הקרח במשך 10 דקות. במהלך הדגירה, מעת לעת להעיף את חרוזים כדי להשתמש בהם שוב.ללכוד את חרוזים מגנטיים על מגנט ולאסוף 15 microliters של אלוט לניתוח כתם מערבי. העבר את האלוטיון הנותר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. כדי לחלץ את ה-RNA, הוסיפו 320 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase ו-400 מיקרוליטרים של אלכוהול איסואמיל פנול-כלורופורם לאלוציון RIPiT.Vortex את התערובת ולאחר מכן צנטריפוגה זה ב 12, 000 גרם במשך חמש דקות. לאסוף 350 microliters של השלב הממימי לתוך צינור נפרד. מוסיפים נתרן אצטט, מגנזיום כלורי, גליקוגן ואתנול לדגימה שנאספה ומדגרים את התערובת בן לילה ב-20 מעלות צלזיוס שליליות.למחרת, גלולה RNA על ידי צנטריפוגה ב 12, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס ולשטוף אותו 70% אתנול. לאחר שטיפת אתנול, לטפל RNA עם T4 פולינוקלאוטריד קינאז, או PNK, ללא כל ATP, ולבצע טיהור פנול-כלורופורם על פי הוראות כתב היד. יש לתפוש מחדש את ה-RNA הנקי ב-4.5 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase.כדי לכמת את תפוקת ה-RNA, יש לכמת את ה-RNA עם PNK ו-32P עם תוויות ATPs בהתאם לכיווני כתב היד. השתמש בסולם DNA לטווח נמוך ואוליגו סינתטי 20 עד 40 נוקלאוטיד לתקני גודל וכמות. פתור את ה- RNA המסומן בג'ל 26%urea-polyacrylamide.מייבשים את הג'ל לפי הוראות כתב היד וחושפים את הג'ל לזרחן עד לזיהוי אות הולם. טכניקה זו שימשה כדי לחקור את האינטראקציות של מתחם צומת אקסון או EJC. ניתוח כתם מערבי של חלבונים מטוהרים מכל שלב עיקרי בהליך RIPiT מראה כי EJC מטוהר מכיל הן EIF4A3 ו MAGOH.הפקד השלילי, HNRNPA1, אינו מזוהה באלוטיון. עוצמת אות טביעת הרגל של RNA תואמת לכמות האינטראקציה של חלבון RNA. טביעת רגל חזקה יותר נצפתה כאשר RIPiT בוצע על תאים שטופלו puromycin, אשר מגביר את התפוסה EJC על RNA.כדי להבטיח שה-RIPiT היה יעיל, חשוב לבדוק את היעילות של ה-IP על ידי כתם מערבי. חשוב גם להעריך את כמות ואיכות ה-RNA לפני שתמשיך ברצף עמוק. בשנת 2018, מעבדת סינג השתמשה בהצלחה בטכניקה זו כדי לטהר שתי וריאציות שונות קומפוזיציה של קומפלקס צומת אקסון ולזהות דפוסי איגוד RNA.אם החוקרים בוחרים לזהות עקבות RNA עם אוטוביוגרפיה, יש לעקוב אחר כל נהלי הבטיחות והפרוטוקולים המתאימים לקרינה.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

תא בודד RNA רצף וניתוח של איי הלבלב האנושי

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...