Name: identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH GM120209 (GS). Gli autori ringraziano oSUCCC Genomics Shared Resources Core per i loro servizi (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).

1. Istituzione di linee cellulari HEK293 stabili che esprimono le proteine di interesse marcate FLAG indecicabili da Tetraciclina (POI)
<ol><li>Cellule di semi HEK293 con un punto di destinazione di ricombinazione Flp (FRT) stabilmente integrato ad una densità di 10 x 104 celle/mL in mezzo di crescita (il mezzo di Eagle modificato di Eagle [DMEM] - 10% siero bovino fetale [FBS] - 1% penicillina-streptomycin [penn/sp]) in 6- piatti ben. Consentire alle cellule di crescere durante la notte in un'incubatrice u...

<ol>
	<li>Karousis, E. D., Nasif, S., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact.">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li><li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+UPF1,+eRFs,+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways.">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li><li>Papasaikas, P., Valc&#225;rcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spliceosome:+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor.">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li><li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins.">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).</li><li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins.">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution.">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(iCLIP)+to+Determine+Protein-RNA+Interactions.">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li><li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPiT-Seq:+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA:protein+complexes.">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li><li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity.">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li><li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM.">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li><li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm.">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li><li>Z&#252;nd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3'+UTRs.">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li><li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing.">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li><li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments.">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).</li><li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase.">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs.">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li><li>Giudice, G., S&#225;nchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs.">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPmap:+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins.">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).</li><li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements.">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li></ol>

Discutiamo qui alcune considerazioni chiave per eseguire con successo RIPiT. In primo luogo, i singoli IP devono essere ottimizzati per ottenere la massima efficienza possibile in ogni fase. La quantità di perline di agarose FLAG per il numero di ingresso di cellule qui descritte si è dimostrata robusta per una vasta gamma di proteine che abbiamo testato. Poiché solo una piccola frazione delle proteine partner è co-immunoprecipitata con la proteina FLAG, la quantità di anticorpi necessari per un IP secondo efficient...

All'interno delle cellule, l'RNA esiste in complesso con proteine per formare complessi di RNA:proteina (RRP). Gli RPP sono assemblati intorno alle proteine leganti l'RNA (RBP, quelle che legano direttamente l'RNA) ma comprendono anche non-RP (quelli che legano gli RBP ma non l'RNA) e sono spesso di natura dinamica. Gli RBP e i loro cofattori funzionano collettivamente all'interno dei RSP per eseguire funzioni normative. Ad esempio, nel percorso di decadimento dell'mRNA mediato senza senso (NMD), le proteine UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) riconoscono il ribosoma terminato prematuramente. Ognuna delle proteine UPF può legarsi all'RNA, ma è solo quando si assemblano insieme che inizia a formarsi un complesso nmD attivo. All'interno di questo complesso, UPF1 è ulteriormente attivato dalla fosforilazione da un SMG1 non-RBP, e tale attivazione UPF1 alla fine porta al reclutamento di fattori di induzione del decadimento mRNA1,2. In questo esempio, gli RBP richiedono cofattori non RBP per il reclutamento e l'attivazione del complesso RNP che attiva NMD. Un'altra proprietà degli RNP è la loro eterogeneità compositiva. Si consideri il spicchio, che esiste in distinti complessi E, A, B o C. Diversi complessi spliceo hanno proteine sovrapposte e distinte3. Per studiare le funzioni di RNP, è importante chiarire quali RNA sono legati da un RBP e le sue proteine associate. Esistono molti metodi per raggiungere questo obiettivo, con ogni approccio che ha i suoi vantaggi e svantaggi distinti4,5,6,7.
I metodi molto popolari per identificare i siti di legame RBP - crosslinking seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) e le sue varie variazioni - si basano sulla luce ultravioletta (UV) per collegare un RBP all'RNA8. Tuttavia, questo non è un approccio efficace per i non-RBP all'interno dei RSP, che non contattano direttamente l'RNA. Qui, descriviamo un approccio alternativo applicabile sia agli RBP che ai non-RBP, per isolare e identificare i loro siti di legame dell'RNA. Questo approccio chiamato immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è costituito da due fasi di immunoprecipitazioni, che aiutano a raggiungere una maggiore specificità rispetto a una singola purificazione (Figura 1)9,10. Poiché le singole fasi di immunoprecipitazioni (IP) possono essere eseguite a una cordenza inferiore rispetto al CLIP, RIPiT non dipende dalla disponibilità di anticorpi in grado di resistere alla presenza di forti detergenti durante l'immunoprecipitazioni. Il vantaggio più unico di RIPiT è la capacità di indirizzare due diverse proteine in due fasi di purificazione; questo fornisce un modo potente per arricchire un complesso RNP compositivamente distinto da altri complessi simili11.
Piccole variazioni alla procedura RIPiT possono migliorare ulteriormente l'arricchimento del RNP. Ad esempio, alcune interazioni RNA-proteina o proteina-proteina all'interno dei RNP sono transitorie e può essere difficile purificare in modo efficiente le impronte di tali complessi. Per stabilizzare tali interazioni, i RNP possono essere incrociati all'interno delle cellule con formaldeide prima della lisi cellulare e RIPiT. Ad esempio, abbiamo osservato che una debole interazione tra il fattore centrale del complesso di giunzione dell'esonio (EJC), EIF4AIII e il fattore di smontaggio dell'EJC, IL PYM12 può essere stabilizzato con il trattamento della formaldeide in modo che vengano arricchite più impronte di RNA (dati non (visualizzato). Prima della raccolta cellulare e RIPiT, le cellule possono anche essere trattate con farmaci per stabilizzare o arricchire i RNP in un determinato stato. Ad esempio, quando si studiano proteine che vengono rimosse dall'mRNA durante la traduzione (ad esempio, l'EJC13, UPF114), il trattamento con inibitori di traduzione come la damacina, il cicloseximide o l'armonica può portare ad un aumento dell'occupazione di proteine sugli RNA.
La quantità di RNA recuperata da RIPiT è solitamente bassa (0,5-10 pmoles, cioè 10-250 ng RNA considerando una lunghezza media dell'RNA di 75 nt). La ragione principale di questo è che solo una piccola frazione di una data proteina è presente in complesso con altre proteine all'interno di RRP (qualsiasi proteina "libera" IP'ed nel primo passo viene persa durante il secondo IP). Per generare librerie RNA-Seq da questo RNA, abbiamo anche delineato qui un adattamento del protocollo pubblicato in precedenza adatto a tali input di RNA bassi15,16 (Figura 2), che produce campioni pronti per la sequenziamento ad alta velocità in 3 Giorni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Anti-FLAG Affinity Gel</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ATP, [&#947;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250&#181;Ci</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:101px;">BLU502A250UC</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Betaine 5M</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B0300</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">biotin-dATP</td>
			<td style="width:112px;">TriLink</td>
			<td style="width:101px;">N-5002</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">biotin-dCTP</td>
			<td style="width:112px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEL540001EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Branson Sonifier, Model SSE-1</td>
			<td style="width:112px;">Branson</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CircLigase I</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">76081-606</td>
			<td style="width:591px;">ssDNA ligase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">11995-065</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DNA load buffer NEB</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Dynabeads Protein A</td>
			<td style="width:112px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">10002D</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">R78007</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">GeneRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:101px;">FERSM1203</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:101px;">10687010</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4565013</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4566033</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRCAT-33 adapter 5&#8242;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mirus transIT-X2 transfection reagent</td>
			<td style="width:112px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 6004</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mth RNA ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2610S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE1.0 5&#8242;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT 
			CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE2.0 5&#8242;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC 
			GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:101px;">BP1752I-100</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Purple Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">NEB #7025</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Q5 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0491S/L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:363px;">RNase I, E. coli, 1000 units</td>
			<td style="width:112px;">Eppicenter</td>
			<td style="width:101px;">N6901K</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">SPIN-X column</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160-24EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Streptavidin beads</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">60210</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Superscript III (SSIII)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">18080044</td>
			<td style="width:591px;">reverse transcriptase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SybrGold</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S11494</td>
			<td style="width:591px;">gold nucleic acid gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:363px;">T4 Polynucleotide Kinase-2500U</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0201L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">T4RNL2 Tr. K227Q</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:101px;">87128</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Thermostable 5&#180; App DNA/RNA Ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0319S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE1 5&#8242;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE10 5&#8242;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE11 5&#8242;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA 
			GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE12 5&#8242;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE2 5&#8242;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE35&#8242;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE4 5&#8242;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE5 5&#8242;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE6 5&#8242;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE7 5&#8242;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT 
			TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE8 5&#8242;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT 
			CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE9 5&#8242;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Typhoon 5 Bimolecular Imager</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td align="right" style="width:101px;">29187191</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)

L'immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è un metodo per arricchire le impronte di RNA di una coppia di proteine all'interno di un complesso RNA:proteina (RNP). RIPiT impiega due fasi di purificazione. In primo luogo, l'immunoprecipitazioni di una sottounità RNP con tag è seguita da una lieve digestione di RNase e dalla successiva elusione di affinità non denatura. Una seconda immunoprecipitazioni di un'altra sottounità RNP consente l'arricchimento di un complesso definito. A seguito di una diluizione di RNA e proteine, le impronte di RNA vengono convertite in librerie di sequenziamento del DNA ad alto valore di produzione. A differenza del più popolare approccio ultravioletto (UV) seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) per arricchire i siti di legame RBP, RIPiT è UV-crosslinking indipendente. Quindi RIPiT può essere applicato a numerose proteine presenti nell'interactoma dell'RNA e oltre che sono essenziali per la regolazione dell'RNA, ma non contattano direttamente l'RNA o UV-crosslink scarsamente all'RNA. Le due fasi di purificazione in RIPiT offrono un ulteriore vantaggio nell'identificare i siti di legame in cui una proteina di interesse agisce in collaborazione con un altro cofattore. La strategia di doppia purificazione serve anche a migliorare il segnale limitando lo sfondo. In questo caso, forniamo una procedura passo-passo per eseguire RIPiT e per generare librerie di sequenziamento ad alta velocità da impronte di RNA isolate. Delineiamo anche i vantaggi e le applicazioni di RIPiT e discutiamo alcune delle sue limitazioni.

Un RIPiT di successo comporterà l'immunoprecipitazioni di proteine di interesse e di altre proteine interagenti note, e l'assenza di proteine non interagenti. Come si è visto nella Figura 3A, sia Magoh che EIF4AIII sono stati rilevati nell'eluzione di RIPiT, ma HNRNPA1 non lo era (lane 6). Parallelamente, le impronte di RNA che hanno co-purificato con i complessi RNP sono state rilevate tramite l'autoradiografia (Figura 3B) o ...

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Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire i siti endogeni di legame dell'RNA o "impronte" di nasi: proteine (RNP) complessi da cellule di mammiferi. Questo approccio comporta due immunoprecipitazioni di sottounità RNP ed è quindi soprannominato immunoprecipitazioni di RNA in tandem (RIPiT).

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

L'immunoprecipitazione dell'RNA in tandem seguita dal sequenziamento, o RIPiT-Seq, è un metodo per identificare quali regioni di RNA sono legate da una particolare coppia di proteine leganti l'RNA. Il vantaggio più unico di RIPiT è la sua capacità di indirizzare due diverse proteine in due purificazione. Questo fornisce un modo potente per arricchire per un complesso proteico di RNA distinto dal punto di vista compositio da altri complessi.Inoltre, RIPiT-Seq è indipendente dal crosslinking UV e può essere applicato a molte proteine che agiscono sull'RNA senza legarlo direttamente. Mentre questo metodo non si estende direttamente verso la terapia o la diagnosi, le proteine leganti l'RNA e l'elaborazione dell'RNA sono state associate a diverse malattie come le neuropatie e il cancro. RIPiT-Seq fornisce uno strumento per lo studio delle funzioni delle proteine leganti l'RNA legate alla malattia.RIPiT-Seq richiede un sistema in cui può essere espressa una proteina con tag epitopo. È stato testato solo nelle cellule HEK293 ed è più suscettibile alla coltura cellulare. Tuttavia, ora con la nostra capacità di etichettare le proteine utilizzando CRISPR, RIPiT-Seq può essere applicabile a diversi sistemi moderni.Il successo del RIPiT dipende da due immunoprecipitazioni efficienti, quindi sarà fondamentale ottimizzare le condizioni di immunoprecipitazione per l'anticorpo utilizzato. Inoltre, lavorare con l'RNA richiede precauzioni adeguate, quindi i reagenti senza RNasi devono essere utilizzati durante e dopo l'estrazione dell'RNA. A dimostrare la procedura sarà Lauren Woodward, una studentessa laureata nel mio laboratorio.Inizia lavando delicatamente le cellule monostrato con 15 millilitri di PBS refrigerato per piastra da 15 centimetri. Quindi raschiare le cellule in 30 millilitri di PBS e raccoglierle in un tubo conico da 50 millilitri. Pellettare le cellule centrifugando a 400 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius e scartare il supernatante.Aggiungere quattro millilitri di tampone di lisi ipotonica ghiacciata e utilizzare una pipetta P1000 per sospendere di nuovo le cellule. Trasferire il lisato in un tubo da cinque millilitri e incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Mettere il lysate in un bagno di ghiaccio e sonicare secondo le indicazioni manoscritte.Quindi aggiungere 108 microlitri di cinque cloruro di sodio molare per regolare la concentrazione di sale a 150 millimolare. Quindi, centrifugare il lisato a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius e raccogliere 20 microlitri del supernatante per l'analisi western blot. Prelavare le perle di agarosio FLAG secondo le indicazioni manoscritte e applicare il supernatante rimanente a 750 microlitri di perline in un tubo da cinque millilitri.Incubare le perle di agarosio FLAG con l'estratto cellulare per una o tre ore a quattro gradi Celsius con una miscelazione delicata. Dopo l'incubazione, pellet le perline per centrifugazione a 400 g per un minuto a quattro gradi Celsius, e raccogliere 20 microlitri del supernatante per l'analisi western blot. Scartare il supernatante rimanente e lavare le perline rimescolandole in quattro millilitri di tampone di lavaggio iso.Pellettare di nuovo le perline e rimuovere il supernatante. Diluire la RNasi I in 750 microlitri di tampone di lavaggio iso secondo le indicazioni manoscritte e aggiungerla alle perle di agarosio FLAG. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius con miscelazione delicata, quindi pelletare le perline per centrifugazione.Raccogli 20 microlitri di supernatante per l'analisi western delle macchie e scarta il resto. Quindi, lavare le perline con tampone di lavaggio iso come descritto in precedenza. Successivamente, eseguire l'eluizione di affinità aggiungendo 375 microlitri di tampone di eluizione alle perline e scuotendo delicatamente la miscela a quattro gradi Celsius per una o due ore.Dopo l'incubazione, pelletare le perline e raccogliere un'aliquota di 15 microliter dell'eluizione per l'analisi della macchia occidentale. Mentre l'eluizione dell'affinità è in corso, eseguire la coniugazione magnetica degli anticorpi delle perline. Inizia lavando 50 microlitri di perline magnetiche in un millilitro di tampone di lavaggio iso.Riprestare le perline in 100 microlitri di tampone di coniugazione e aggiungere la quantità appropriata di anticorpi. Quindi, incubare le perline per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le perline magnetiche due volte con tampone di coniugazione e rimorsi le perline in 375 microlitri del tampone di diluizione RIPiT.Conservare le perline sul ghiaccio fino all'immunoprecipitazione. Applicare l'eluizione di affinità FLAG sulle perline magnetiche accoppiate agli anticorpi e incubare con miscelazione delicata per una o due ore a quattro gradi Celsius. Cattura le perline magnetiche con un magnete e raccogli 15 microlitri di supernatante per l'analisi western blot.Quindi, lavare le perline sette volte con tampone di lavaggio iso. Procedere con l'eluizione denaturante rimospendendo le perline magnetiche in 100 microlitri di tampone di campioni chiari e incubando la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti. Durante l'incubazione, scorrere periodicamente le perline per riprerne.Cattura le perline magnetiche su un magnete e raccogli 15 microlitri di eluizione per l'analisi western blot. Trasferire l'eluizione rimanente in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Per estrarre l'RNA, aggiungere 320 microlitri di acqua priva di RNasi e 400 microlitri di alcol isoamile fenolo-cloroformio all'eluizione RIPiT.Vortice la miscela e poi centrifugarla a 12.000 g per cinque minuti. Raccogliere 350 microlitri della fase acquosa in un tubo separato. Aggiungere acetato di sodio, cloruro di magnesio, glicogeno ed etanolo al campione raccolto e incubare la miscela durante la notte a -20 gradi Celsius.Il giorno successivo, pellet l'RNA per centrifugazione a 12.000 g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e lavarlo in 70%etanolo. Dopo il lavaggio dell'etanolo, trattare l'RNA con T4 polinucleotide chinasi, o PNK, senza alcun ATP, ed eseguire la purificazione fenolo-cloroformio secondo le indicazioni manoscritte. Rimescolare l'RNA pulito in 4,5 microlitri di acqua priva di RNasi.Per quantificare la resa dell'RNA, etichettare l'RNA con PNK e 32P etichettati ATP secondo le indicazioni manoscritte. Utilizzare una scala del DNA a bassa gamma e un oligo sintetico da 20 a 40 nucleotidi per gli standard di dimensioni e quantità. Risolvere l'RNA etichettato su un gel urea-poliacrilammide al 26%.Asciugare il gel secondo le indicazioni del manoscritto ed esporre il gel a un fosfoscreen fino a quando non viene rilevato un segnale adeguato. Questa tecnica è stata utilizzata per indagare le interazioni del complesso di giunzione dell'esone o EJC. L'analisi western delle proteine purificate da ogni fase principale della procedura RIPiT mostra che l'EJC purificato contiene sia EIF4A3 che MAGOH.Il controllo negativo, HNRNPA1, non viene rilevato nell'eluizione. La forza del segnale di ingombro dell'RNA è correlata alla quantità di interazione della proteina RNA. Un'impronta più forte si osserva quando il RIPiT è stato eseguito su cellule trattate con puromicina, il che aumenta l'occupazione EJC sull'RNA.Per garantire che il RIPiT sia stato efficace, è importante testare l'efficienza dell'IP tramite western blot. È anche importante valutare la quantità e la qualità dell'RNA prima di procedere con il sequenziamento profondo. Nel 2018, il laboratorio Singh ha utilizzato con successo questa tecnica per purificare due variazioni distinte dal punto di vista compositivo del complesso di giunzione dell'esone e identificare i modelli di legame dell'RNA.Se i ricercatori scelgono di rilevare impronte di RNA con autorazione, dovrebbero essere seguite tutte le procedure e i protocolli di sicurezza delle radiazioni appropriati.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Ricerca

Genetica

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Indagine della sintesi di RNA usando 5-Bromouridine di etichettatura e di immunoprecipitazione

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complessi di allungamento dell'RNA artificiale Polymerase II per eventi di elaborazione dell'RNA co-trascrizione

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identificazione di RNA circolari mediante il sequenziamento dell'RNA

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening e identificazione dei soppressori del silenziamento dell'RNA da parte degli effetti segreti dei patogeni vegetali

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Profilazione a livello di trascrizione delle interazioni proteina-RNA attraverso il cross-linking e l'immunoprecipitazione mediata dalla purificazione tandem FLAG-Biotina

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Individuazione degli obiettivi normativi CsgD nel biofilm della Salmonella mediante l'immunoprecipitazioni della cromatina e il sequenziamento ad alto rendimento (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...