Name: identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant GM120209 (GS). Forfatterne takker OSUCCC Genomics delte ressurser Core for sine tjenester (CCC support Grant NCI P30 CA16058).

1. etablering av stabil HEK293 Cell Lines uttrykke Tetracycline-induserbart FLAG-Tagged protein av interesse (POI)
<ol><li>Seed HEK293 celler med et stabilt integrert FLP rekombinasjon Target (FRT) område ved en tetthet på 10 x 104 celler/ml i vekstmedium (Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium [DMEM] + 10% fosterets storfe serum [FBS] + 1% penicillin-Streptomycin [penn/strep]) i 6- brønn plater. Tillat at cellene vokser over natten i en fuktet inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 (standard vekstbeti...

<ol>
	<li>Karousis, E. D., Nasif, S., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact.">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li><li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+UPF1,+eRFs,+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways.">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li><li>Papasaikas, P., Valc&#225;rcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spliceosome:+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor.">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li><li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins.">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).</li><li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins.">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution.">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(iCLIP)+to+Determine+Protein-RNA+Interactions.">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li><li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome&#8208;wide+protein-RNA+interactions.">Advances and challenges in the detection of transcriptome&#8208;wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li><li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus.">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li><li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPiT-Seq:+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA:protein+complexes.">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li><li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity.">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li><li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM.">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li><li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm.">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li><li>Z&#252;nd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3'+UTRs.">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li><li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing.">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li><li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments.">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).</li><li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase.">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs.">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li><li>Giudice, G., S&#225;nchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs.">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPmap:+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins.">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).</li><li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements.">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li></ol>

Vi diskuterer her noen viktige hensyn å kunne utføre RIPiT. Fremst må individuelle IP-adresser optimaliseres for å oppnå høyest mulig effektivitet på hvert trinn. Mengden av FLAG agarose perler for input antall celler som er beskrevet her har vist seg å være robust for et bredt spekter av proteiner vi har testet. Som bare en liten brøkdel av partner proteiner er co-immunoprecipitated med FLAGGET protein, er mengden av antistoff som trengs for effektiv andre IP vanligvis lav (mindre enn 10 μg). Småskala RIPiT ...

I cellene finnes RNA i komplekse med proteiner for å danne RNA: protein komplekser (RNPs). RNPs er satt sammen rundt RNA-bindende proteiner (RBPs, de som direkte binder RNA), men også består av ikke-RBPs (de som binder RBPs, men ikke RNA), og som ofte er dynamiske i naturen. RBPs og deres kofaktorer funksjon kollektivt innenfor RNPs å utføre regulatoriske funksjoner. For eksempel gjenkjenner UPF-proteinene (UPF1, UPF2 og UPF3b) den for tidlig avsluttet ribosom i den nonsense-mediert mRNA forfallet (NMD)-veien. Hvert av UPF-proteinene kan bindes til RNA, men det er først når de monterer sammen at et aktivt NMD-kompleks begynner å dannes. Innenfor dette komplekset blir UPF1 videre aktivert av fosforylering av en ikke-RBP SMG1, og slike UPF1 aktivisering fører til slutt til rekruttering av mRNA forfall inducing faktorer1,2. I dette eksempelet krever RBPs ikke-RBP kofaktorer for rekruttering og aktivering av RNP-komplekset som utløser NMD. Enda en eiendom av RNPs er deres heterogenitet. Vurder spliceosome, som finnes i distinkte E, A, B eller C komplekser. Ulike spliceosome komplekser har overlappende og distinkte proteiner3. For å studere RNP-funksjoner er det viktig å belyse hvilke RNAs som er bundet av en RBP og tilhørende proteiner. Mange metoder finnes for å oppnå dette, med hver tilnærming har sine distinkte fordeler og ulemper4,5,6,7.
Den allment populære metoder for å identifisere RBP bindende nettsteder-Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) og dens ulike variasjoner-stole på ultrafiolett (UV) lys for å krysskobling en RBP til RNA8. Dette er imidlertid ikke en effektiv tilnærming for ikke-RBPs innen RNPs, som ikke kontakter RNA direkte. Her beskriver vi en alternativ tilnærming som gjelder for både RBPs og ikke-RBPs, for å isolere og identifisere deres RNA bindende nettsteder. Denne tilnærmingen kalles RNA immunutfelling i tandem (RIPiT) består av to immunutfelling trinn, som bidrar til å oppnå høyere spesifisitet i forhold til en enkelt rensing (figur 1)9,10. Som individuelle immunutfelling (IP) trinnene kan utføres ved en lavere stringens i forhold til CLIP, RIPiT ikke avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer som tåler tilstedeværelsen av sterke vaskemidler under immunutfelling. Den mest unike fordelen med RIPiT er evnen til å målrette to forskjellige proteiner i to rensing trinn; Dette gir en effektiv måte å berike en sammensetningsmessig distinkt RNP kompleks fra andre lignende komplekser11.
Små variasjoner i RIPiT prosedyren kan ytterligere forsterke RNP berikelse. For eksempel, noen RNA-protein eller protein-protein interaksjoner innen RNPs er forbigående, og det kan være vanskelig å effektivt rense overføringene av slike komplekser. For å stabilisere slike interaksjoner, kan RNPs være krysskoblet i celler med formaldehyd før cellelyse og RIPiT. For eksempel har vi observert at en svak interaksjon mellom ekson Junction kompleks (EJC) kjerne faktor, EIF4AIII og EJC demontering faktor, PYM12 kan stabiliseres med formaldehyd behandling slik at mer RNA fotavtrykk er beriket (data ikke vises). Før celle høsting og RIPiT, celler kan også behandles med medikamenter for å stabilisere eller berike RNPs i en bestemt tilstand. For eksempel, når du studerer proteiner som er fjernet fra mRNA under oversettelsen (f. eks, EJC13, UPF114), behandling med oversettelse hemmere som puromycin, cycloheximide eller harringtonine kan føre til økt belegg av proteiner på RNAs.
Mengden av RNA utvinnes fra RIPiT er vanligvis lav (0,5-10 pmoles, dvs, 10-250 ng RNA vurderer en gjennomsnittlig RNA lengde på 75 NT). Den primære årsaken til dette er at bare en liten brøkdel av et gitt protein er til stede i komplekse med andre proteiner i RNPs (noen "gratis" protein IP'ed i første trinn er tapt under den andre IP). For å generere RNA-SEQ-bibliotekene fra denne RNA-en, skisserer vi også her en tilpasning av tidligere utgitte protokoll egnet for slike lave RNA-innganger15,16 (figur 2), som gir klare prøver med høy gjennomstrømming i 3 Dager.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Anti-FLAG Affinity Gel</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ATP, [&#947;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250&#181;Ci</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:101px;">BLU502A250UC</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Betaine 5M</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B0300</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">biotin-dATP</td>
			<td style="width:112px;">TriLink</td>
			<td style="width:101px;">N-5002</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">biotin-dCTP</td>
			<td style="width:112px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEL540001EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Branson Sonifier, Model SSE-1</td>
			<td style="width:112px;">Branson</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CircLigase I</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">76081-606</td>
			<td style="width:591px;">ssDNA ligase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">11995-065</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DNA load buffer NEB</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Dynabeads Protein A</td>
			<td style="width:112px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">10002D</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">R78007</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">GeneRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:101px;">FERSM1203</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:101px;">10687010</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4565013</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4566033</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRCAT-33 adapter 5&#8242;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mirus transIT-X2 transfection reagent</td>
			<td style="width:112px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 6004</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mth RNA ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2610S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE1.0 5&#8242;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT 
			CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE2.0 5&#8242;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC 
			GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:101px;">BP1752I-100</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Purple Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">NEB #7025</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Q5 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0491S/L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:363px;">RNase I, E. coli, 1000 units</td>
			<td style="width:112px;">Eppicenter</td>
			<td style="width:101px;">N6901K</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">SPIN-X column</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160-24EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Streptavidin beads</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">60210</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Superscript III (SSIII)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">18080044</td>
			<td style="width:591px;">reverse transcriptase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SybrGold</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S11494</td>
			<td style="width:591px;">gold nucleic acid gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:363px;">T4 Polynucleotide Kinase-2500U</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0201L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">T4RNL2 Tr. K227Q</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:101px;">87128</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Thermostable 5&#180; App DNA/RNA Ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0319S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE1 5&#8242;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE10 5&#8242;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE11 5&#8242;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA 
			GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE12 5&#8242;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE2 5&#8242;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE35&#8242;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE4 5&#8242;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE5 5&#8242;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE6 5&#8242;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE7 5&#8242;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT 
			TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE8 5&#8242;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT 
			CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE9 5&#8242;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Typhoon 5 Bimolecular Imager</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td align="right" style="width:101px;">29187191</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)

RNA-immunutfelling i tandem (RIPiT) er en metode for å berike RNA-avtrykk av et par proteiner i et RNA: protein (RNP)-kompleks. RIPiT sysselsetter to rensing trinn. Først immunutfelling av en kodet RNP delenhet etterfølges av mild RNase fordøyelse og påfølgende ikke-denaturering affinitet eluering. En annen immunutfelling av et annet RNP delenhet tillater berikelse av et definert kompleks. Etter en denaturering eluering av RNAs og proteiner omdannes RNA-overføringene til biblioteker med høy gjennomstrømming for DNA-sekvenser. I motsetning til de mer populære ultrafiolette (UV) Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) tilnærming til å berike RBP bindende områder, er RIPiT UV-Cross Linking uavhengig. Derfor kan RIPiT brukes på en rekke proteiner som finnes i RNA-interactome, og utover det som er avgjørende for RNA-regulering, men ikke direkte kontakt RNA-eller UV-krysskobling dårlig til RNA. De to rensing trinnene i RIPiT gir en ekstra fordel av å identifisere bindende områder der et protein av interesse opptrer i samarbeid med en annen kofaktor. Den doble rensing strategien tjener også til å forbedre signalet ved å begrense bakgrunnen. Her gir vi en trinnvis fremgangsmåte for å utføre RIPiT og generere høy gjennomstrømming sekvensering biblioteker fra isolerte RNA fotavtrykk. Vi har også skissere RIPiT fordeler og programmer og diskutere noen av sine begrensninger.

En vellykket RIPiT vil resultere i immunutfelling av både proteiner av interesse og andre kjente samspill proteiner, og fraværet av ikke-samspill proteiner. Som sett i Figur 3A, ble både Magoh og EIF4AIII påvist i RIPIT eluering, men HNRNPA1 var ikke (Lane 6). Parallelt ble RNA fotavtrykk som har co-renset med RNP komplekser oppdaget via autoradiografi (Figur 3B) eller bioanalyzer (Figur 3<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

Her presenterer vi en protokoll for å berike endogene RNA bindende nettsteder eller "fotavtrykk" av RNA: protein (RNP) komplekser fra pattedyrceller. Denne tilnærmingen innebærer to immunoprecipitations av RNP under enheter og er derfor kalt RNA immunutfelling i tandem (RIPiT).

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

RNA immunforeleggelse i tandem etterfulgt av sekvensering, eller RIPiT-Seq, er en metode for å identifisere hvilke regioner av RNA som er bundet av et bestemt par RNA bindende proteiner. Den mest unike fordelen med RIPiT er dens evne til å målrette to forskjellige proteiner i to renser. Dette gir en kraftig måte å berike for et kompositorisk distinkt RNA-proteinkompleks fra andre komplekser.RiPiT-Seq er også UV-kryssbinding uavhengig, og kan brukes på mange proteiner som virker på RNA uten å binde den direkte. Selv om denne metoden ikke strekker seg direkte mot terapi eller diagnose, har RNA bindende proteiner og RNA-behandling vært forbundet med flere sykdommer som nevropatier og kreft. RIPiT-Seq gir et verktøy for å studere funksjoner av sykdomsrelaterte RNA bindende proteiner.RIPiT-Seq krever et system der et epitop-merket protein kan uttrykkes. Det har bare blitt testet i HEK293 celler, og er mest mottagelig for cellekultur. Men nå med vår evne til å tagge proteiner ved hjelp av CRISPR, kan RIPiT-Seq gjelde for ulike moderne systemer.Suksessen til RIPiT avhenger av to effektive immunforekomst, så det vil være avgjørende å optimalisere immunforekomstforholdene for antistoffet som brukes. Også arbeid med RNA krever riktige forholdsregler, så RNase-frie reagenser bør brukes under og etter RNA-ekstraksjon. Å demonstrere prosedyren vil være Lauren Woodward, en utdannet student i laboratoriet mitt.Start med å vaske monolayer celler forsiktig med 15 milliliter kjølt PBS per 15 centimeter plate. Skrap deretter av celler i 30 milliliter PBS og samle dem i et 50 milliliter konisk rør. Pellet cellene ved å sentrifugere ved 400 g i 10 minutter ved 4 grader Celsius, og kast det overnaturlige.Tilsett fire milliliter iskald hypotonisk lysisbuffer og bruk en P1000-pipette til å suspendere cellene på nytt. Overfør lysatet til et fem milliliter rør og inkuber på is i 10 minutter. Plasser lysate i et isbad og sonikere i henhold til manuskriptretninger.Tilsett deretter 108 mikroliter med fem molarnatriumklorid for å justere saltkonsentrasjonen til 150 millimolar. Deretter sentrifugere lysatet på 12,000 g i 10 minutter ved fire grader Celsius, og samle 20 mikroliter av supernatant for vestlig flekk analyse. Pre-vask FLAG agarose perler i henhold til manuskript retninger og bruke gjenværende supernatant til 750 mikroliter perler i en fem milliliter tube.Inkuber FLAG agarose perler med celleekstraktet i en til tre timer ved fire grader Celsius med mild blanding. Etter inkubasjon, pellet perlene ved sentrifugering på 400 g i ett minutt ved fire grader Celsius, og samle 20 mikroliter av supernatant for vestlig flekk analyse. Kast de resterende supernatante og vask perlene ved å bruke dem på fire milliliter iso vaskbuffer.Pellet perlene igjen og fjern supernatant. Fortynn RNase I i 750 mikroliter iso vaskbuffer i henhold til manuskriptretninger, og legg den til FLAG agarose perler. Inkuber blandingen ved fire grader Celsius med mild blanding, og pellet deretter perlene ved sentrifugering.Samle 20 mikroliter supernatant for vestlig flekkanalyse, og kast resten. Vask deretter perlene med iso vaskebuffer som tidligere beskrevet. Deretter utfører du affinitetsution ved å legge til 375 mikroliter elutionbuffer til perlene, og riste blandingen forsiktig ved fire grader Celsius i en til to timer.Etter inkubasjon, pellet perlene og samle en 15 mikroliter aliquot av elution for vestlig flekk analyse. Mens affinitet elution er i gang, utføre magnetisk perle antistoff bøyning. Begynn med å vaske 50 mikroliter magnetiske perler i en milliliter iso vaskbuffer.Resuspend perlene i 100 mikroliter konjugeringsbuffer og legg til riktig mengde antistoff. Deretter inkuber perlene i minst 10 minutter ved romtemperatur. Vask de magnetiske perlene to ganger med bøyningsbuffer og resuspend perlene i 375 mikroliter ripit fortynningsbuffer.Oppbevar perlene på is til immunforutståelse. Påfør FLAG affinitet elution til antistoff-skrevet magnetiske perler og inkubere med mild blanding i en til to timer ved fire grader Celsius. Fang de magnetiske perlene med en magnet og samle 15 mikroliter supernatant for vestlig flekkanalyse.Vask deretter perlene syv ganger med iso vaskbuffer. Fortsett med denaturing elution ved å gjenopplive magnetiske perler i 100 mikroliter klar prøvebuffer og inkubere suspensjonen på is i 10 minutter. Under inkubasjon, knips regelmessig perlene for å gjenopplive dem.Fang de magnetiske perlene på en magnet og samle 15 mikroliter av elution for vestlig flekkanalyse. Overfør resten av eliminasjonen til et nytt 1,5 milliliter rør. For å trekke ut RNA, tilsett 320 mikroliter RNase-fritt vann og 400 mikroliter fenolklorform isoamylalkohol til RIPiT-elutionen.Vortex blandingen og sentrifuger den på 12.000 g i fem minutter. Samle 350 mikroliter av vandig fase i et eget rør. Tilsett natriumacetat, magnesiumklorid, glykogen og etanol til den oppsamlede prøven og inkuber blandingen over natten ved negative 20 grader Celsius.På neste dag, pellet RNA ved sentrifugering på 12,000 g i 30 minutter ved fire grader Celsius og vaske den i 70% etanol. Etter etanolvasken, behandle RNA med T4 polynukleotid kinase, eller PNK, uten ATP, og utføre fenol-kloroform rensing i henhold til manuskript retninger. Bruk den rene RNA i 4,5 mikroliter rnasefritt vann.For å kvantifisere RNA-utbyttet, må RNA med PNK og 32P-merkede ATPer kvantifisere RNA-utbyttet. Bruk en DNA-stige med lavt område og en 20 til 40 nukleotid syntetisk oligo for størrelses- og mengdestandarder. Løs merket RNA på en 26% urea-polyakrylamidgel.Tørk gelen i henhold til manuskriptets retninger og utsett gelen for et fosfoscreen til tilstrekkelig signal oppdages. Denne teknikken har blitt brukt til å undersøke interaksjonene til exon junction kompleks eller EJC. Vestlig flekkanalyse av proteiner renset fra hvert hovedtrinn i RIPiT-prosedyren viser at renset EJC inneholder både EIF4A3 og MAGOH.Den negative kontrollen, HNRNPA1, oppdages ikke i elution. Styrken av RNA fotavtrykk signal korrelerer med mengden av RNA protein interaksjon. Et sterkere fotavtrykk observeres når RIPiT ble utført på celler behandlet med puromycin, noe som øker EJC-belegget på RNA.For å sikre at RIPiT har vært effektiv, er det viktig å teste effektiviteten til IP av vestlige blot. Det er også viktig å vurdere mengden og kvaliteten på RNA før du fortsetter med dyp sekvensering. I 2018 brukte Singh-laboratoriet denne teknikken til å rense to kompositoriske forskjellige varianter av exon-koblingskomplekset og identifisere RNA-bindingsmønstre.Hvis forskere velger å oppdage RNA-fotavtrykk med autoradiografi, bør alle riktige strålingssikkerhetsprosedyrer og protokoller følges.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Undersøkelse av RNA syntese med 5-Bromouridine merking og Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Single-Cell RNA sekvensering og analyse av Human bukspyttkjertelen holmer

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifikasjon av sirkulær RNAs ved hjelp av RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening og identifisering av RNA-dempende suppressorer fra utskillede effektorer av plantepatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Transkripsjonsomfattende profilering av protein-RNA interaksjoner ved krysskobling og immunoprecipitation mediert av FLAG-Biotin Tandem rensing

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Oppdagelse CsgD regulere mål inne Salmonella biofilm benytter kromatin Immunutfelling og høy-produksjon sekvensering (flis-SEQ)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...