Name: identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)
Uploaded: 2019-07-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grant GM120209 (GS). Författarna tackar OSUCCC Genomics Shared Resources Core för sina tjänster (CCC stöd Grant NCI P30 CA16058).

1. upprättande av stabila HEK293 cellinjer uttrycker tetracyklin-inducerbara flagga-märkt protein av intresse (POI)
<ol><li>Seed HEK293 celler med ett stabilt integrerat FLP rekombination mål (FRT) plats med en densitet av 10 x 104 celler/ml i odlingssubstrat (Dulbecco modifierade Eagle ' s medium [DMEM] + 10% foster bovint serum [FBS] + 1% penicillin-streptomycin [Penn/STREP]) i 6- Bra tallrikar. Låt cellerna växa över natten i en Befuktad inkubator vid 37 ° c och 5% CO2 (standard tillväx...

<ol>
	<li>Karousis, E. D., Nasif, S., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense-mediated+mRNA+decay:+novel+mechanistic+insights+and+biological+impact.">Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).</li><li>Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+UPF1,+eRFs,+PABP+and+the+exon+junction+complex+suggest+an+integrated+model+for+mammalian+NMD+pathways.">Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways.</a> The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).</li><li>Papasaikas, P., Valc&#225;rcel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spliceosome:+The+Ultimate+RNA+Chaperone+and+Sculptor.">The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).</li><li>Jensen, K. B., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLIP:+Crosslinking+and+ImmunoPrecipitation+of+In+Vivo+RNA+Targets+of+RNA-Binding+Proteins.">CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).</li><li>Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CLIP+for+Discovering+Target+Sites+of+RNA-Binding+Proteins.">PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins.</a> mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).</li><li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iCLIP+-+Transcriptome-wide+Mapping+of+Protein-RNA+Interactions+with+Individual+Nucleotide+Resolution.">iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).</li><li>Sibley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+Nucleotide+Resolution+UV+Cross-Linking+and+Immunoprecipitation+(iCLIP)+to+Determine+Protein-RNA+Interactions.">Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions.</a> RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).</li><li>Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+challenges+in+the+detection+of+transcriptome&#8208;wide+protein-RNA+interactions.">Advances and challenges in the detection of transcriptome&#8208;wide protein-RNA interactions.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).</li><li>Singh, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+EJC+Interactome+Reveals+Higher-Order+mRNP+Structure+and+an+EJC-SR+Protein+Nexus.">The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus.</a> Cell. 151, 750-764 (2012).</li><li>Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RIPiT-Seq:+A+high-throughput+approach+for+footprinting+RNA:protein+complexes.">RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes.</a> Methods. 65, 320-332 (2014).</li><li>Mabin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Exon+Junction+Complex+Undergoes+a+Compositional+Switch+that+Alters+mRNP+Structure+and+Nonsense-Mediated+mRNA+Decay+Activity.">The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity.</a> Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).</li><li>Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+Exon+Junction+Complexes+by+PYM.">Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM.</a> Cell. 137 (3), 536-548 (2009).</li><li>Dostie, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+Is+Required+to+Remove+Y14+from+mRNAs+in+the+Cytoplasm.">Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm.</a> Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).</li><li>Z&#252;nd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., M&#252;hlemann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation-dependent+displacement+of+UPF1+from+coding+sequences+causes+its+enrichment+in+3'+UTRs.">Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).</li><li>Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+Identification+of+Recombinant+Argonaute-Bound+Small+RNAs+Using+Next-Generation+Sequencing.">Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing.</a> Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).</li><li>Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+kit-free+method+for+making+strand-specific+deep+sequencing+libraries+from+RNA+fragments.">An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments.</a> Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).</li><li>Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3'-Phosphatase+activity+in+T4+polynucleotide+kinase.">3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase.</a> Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).</li><li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation.">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li><li>Lackner, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+strategy+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+tagging.">A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging.</a> Nature Communications. 6, 10237 (2015).</li><li>Metkar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Organization+Principles+of+Pre-translational+mRNPs.">Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs.</a> Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).</li><li>Giudice, G., S&#225;nchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATtRACT-a+database+of+RNA-binding+proteins+and+associated+motifs.">ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RBPmap:+a+web+server+for+mapping+binding+sites+of+RNA-binding+proteins.">RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins.</a> Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).</li><li>Sundararaman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resources+for+the+Comprehensive+Discovery+of+Functional+RNA+Elements.">Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements.</a> Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).</li></ol>

Vi diskuterar här några viktiga överväganden för att framgångsrikt utföra RIPiT. Främst måste enskilda IP-adresser optimeras för att uppnå högsta möjliga effektivitet vid varje steg. Mängden flagg-Agreste pärlor för inmatnings antalet celler som beskrivs här har visat sig vara robust för ett brett spektrum av proteiner vi har testat. Eftersom endast en bråkdel av partner proteiner är co-immunoprecierade med flagg proteinet, är den mängd antikroppar som behövs för effektiv andra IP vanligtvis låg ...

Inom celler finns RNA i komplex med proteiner för att bilda RNA: proteinkomplex (RNPs). RNPs monteras runt RNA bindande proteiner (RBPs, de som binder direkt RNA) men också bestå av icke-RBPs (de som binder RBPs men inte RNA), och är ofta dynamiska i naturen. RBPs och deras kofaktorer fungerar kollektivt inom RNPs för att utföra reglerande funktioner. Till exempel, i den nonsens-medierade mRNA Decay (NMD) vägen, UPF proteiner (UPF1, UPF2, och UPF3b) erkänna förtida avslutad Ribosomen. Var och en av UPF proteiner kan binda till RNA, men det är först när de samlas ihop att ett aktivt NMD-komplex börjar bildas. Inom detta komplex, UPF1 aktiveras ytterligare genom fosforylering av en icke-RBP SMG1, och sådana UPF1 aktivering så småningom leder till rekrytering av mRNA förfall inducerande faktorer1,2. I det här exemplet kräver RBPs icke-RBP kofaktorer för rekrytering och aktivering av RNP-komplexet som utlöser NMD. Ännu en annan egenskap hos RNPs är deras sammansättning heterogenitet. Betrakta spliceosome, som finns i distinkta E, A, B eller C komplex. Olika spliceosome komplex har överlappande och distinkta proteiner3. För att studera RNP-funktioner är det viktigt att belysa vilka RNAs som är bundna av en RBP och dess associerade proteiner. Många metoder finns för att åstadkomma detta, med varje strategi med sina distinkta fördelar och nackdelar4,5,6,7.
De mycket populära metoder för att identifiera RBP bindningsställen-crosslinking följt av immunoprecipitation (CLIP) och dess olika variationer-förlita sig på ultraviolett (UV) ljus för att Crosslink en RBP till RNA8. Detta är dock inte en effektiv metod för icke-RBPs inom RNPs, som inte kontakta RNA direkt. Här beskriver vi en alternativ metod som är tillämplig på RBPs och icke-RBPs, för att isolera och identifiera deras RNA-bindnings platser. Detta tillvägagångssätt kallas RNA immunoprecipitation i tandem (ripit) består av två immunoprecipitation steg, som bidrar till att uppnå högre specificitet jämfört med en enda rening (figur 1)9,10. Eftersom de enskilda immunoprecipitation (IP) steg kan utföras vid en lägre stränghet jämfört med CLIP, är RIPiT inte beroende av tillgången på antikroppar som tål förekomst av starka rengöringsmedel under immunoprecipitation. Den mest unika fördelen med RIPiT är förmågan att rikta in två olika proteiner i två reningssteg; Detta ger ett kraftfullt sätt att berika en sammansättning distinkt RNP komplex från andra liknande komplex11.
Små variationer i RIPiT-proceduren kan ytterligare förstärka RNP-berikningen. Till exempel, vissa RNA-protein eller protein-protein interaktioner inom RNPs är övergående och det kan vara svårt att effektivt rena fotspår av sådana komplex. För att stabilisera sådana interaktioner kan RNPs tvärbunden i celler med formaldehyd före celllys och RIPiT. Till exempel har vi konstaterat att en svag interaktion mellan exon Junction Complex (EJC) Core Factor, EIF4AIII och EJC demontering faktorn, PYM12 kan stabiliseras med formaldehyd behandling så att fler RNA-fotavtryck är berikade (data inte visas). Innan cell skörd och RIPiT, celler kan också behandlas med läkemedel för att stabilisera eller berika RNPs i ett visst tillstånd. Till exempel, när man studerar proteiner som avlägsnas från mRNA under översättningen (t. ex. EJCUPF1),kan behandling med översättnings hämmare som puromycin, cykloheximid eller harringtonin leda till ökad beläggning av proteiner på RNAs.
Mängden RNA som återvinns från RIPiT är vanligtvis låg (0.5-10 pmoles, dvs, 10-250 ng RNA med tanke på en genomsnittlig RNA-längd på 75 NT). Den främsta orsaken till detta är att endast en liten del av ett givet protein finns i komplex med andra proteiner inom RNPs (alla "fria" protein Ip' ed i det första steget går förlorad under den andra UNDERSÖKNINGSPERIODEN). För att generera RNA-SEQ-bibliotek från detta RNA, skisserar vi också här en anpassning av tidigare publicerade protokoll som lämpar sig för så låga RNA-ingångar15,16 (figur 2), vilket ger hög genomströmning sekvensering redo prover i 3 Dagar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1167px;" width="1166">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Anti-FLAG Affinity Gel</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">A2220</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">ATP, [&#947;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml EasyTide, 250&#181;Ci</td>
			<td style="width:112px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:101px;">BLU502A250UC</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Betaine 5M</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td style="width:101px;">B0300</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">biotin-dATP</td>
			<td style="width:112px;">TriLink</td>
			<td style="width:101px;">N-5002</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">biotin-dCTP</td>
			<td style="width:112px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEL540001EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Branson Sonifier, Model SSE-1</td>
			<td style="width:112px;">Branson</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">CircLigase I</td>
			<td style="width:112px;">VWR</td>
			<td style="width:101px;">76081-606</td>
			<td style="width:591px;">ssDNA ligase I</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">11995-065</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">DNA load buffer NEB</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Dynabeads Protein A</td>
			<td style="width:112px;">LifeTech</td>
			<td style="width:101px;">10002D</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Flp-In-T-REx 293 Cell Line</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">R78007</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">GeneRuler Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:101px;">FERSM1203</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td align="right" style="width:101px;">10687010</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4565013</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel</td>
			<td style="width:112px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:101px;">4566033</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">miRCAT-33 adapter 5&#8242;-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mirus transIT-X2 transfection reagent</td>
			<td style="width:112px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 6004</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mth RNA ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E2610S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE1.0 5&#8242;-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT 
			CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE2.0 5&#8242;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC 
			GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100ml)</td>
			<td style="width:112px;">Fisher</td>
			<td style="width:101px;">BP1752I-100</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Purple Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">NEB #7025</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Q5 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0491S/L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:363px;">RNase I, E. coli, 1000 units</td>
			<td style="width:112px;">Eppicenter</td>
			<td style="width:101px;">N6901K</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">SPIN-X column</td>
			<td style="width:112px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160-24EA</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Streptavidin beads</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">60210</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Superscript III (SSIII)</td>
			<td style="width:112px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:101px;">18080044</td>
			<td style="width:591px;">reverse transcriptase enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">SybrGold</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S11494</td>
			<td style="width:591px;">gold nucleic acid gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:363px;">T4 Polynucleotide Kinase-2500U</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0201L</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">T4RNL2 Tr. K227Q</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:112px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:101px;">87128</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Thermostable 5&#180; App DNA/RNA Ligase</td>
			<td style="width:112px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0319S</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE1 5&#8242;-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE10 5&#8242;-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE11 5&#8242;-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA 
			GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE12 5&#8242;-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE2 5&#8242;-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE35&#8242;-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT 
			CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE4 5&#8242;-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE5 5&#8242;-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA 
			GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC 
			TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE6 5&#8242;-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE7 5&#8242;-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG 
			AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT 
			TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE8 5&#8242;-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT 
			CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruSeq_SE9 5&#8242;-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG 
			CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC 
			CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3&#8242;</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
			<td style="width:591px;">this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:363px;">Typhoon 5 Bimolecular Imager</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td align="right" style="width:101px;">29187191</td>
			<td style="width:591px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of footprints of rna:protein complexes via rna immunoprecipitation in tandem followed by sequencing (ripit-seq)

RNA-immunoprecipitation i tandem (RIPiT) är en metod för att berika RNA-fotavtryck av ett par proteiner inom ett RNA: protein (RNP)-komplex. RIPiT sysselsätter två reningssteg. Första, immunoprecipitation av en taggad RNP subenhet följs av mild RNase matsmältning och efterföljande icke-denaturering samhörighet eluering. En andra immunoprecipitation av en annan RNP subenhet möjliggör berikning av ett definierat komplex. Efter en denaturerande eluering av RNAs och proteiner omvandlas RNA-fotavtryck till högpresterande DNA-sekvenserings bibliotek. Till skillnad från den mer populära ultraviolett (UV) tvärbindning följt av immunoprecipitation (CLIP) metod för att berika RBP bindningsställen, är RIPiT UV-crosslinking oberoende. Därför RIPiT kan appliceras på många proteiner som finns i RNA interactome och därefter som är viktiga för RNA-reglering men inte direkt kontakta RNA eller UV-Crosslink dåligt till RNA. De två reningsstegen i RIPiT ger en ytterligare fördel av att identifiera bindnings platser där ett protein av intresse agerar i partnerskap med en annan kofaktor. Den dubbla renings strategin tjänar också till att förbättra signalen genom att begränsa bakgrunden. Här ger vi ett steg-Wise förfarande för att utföra RIPiT och generera hög dataflöde sekvensering bibliotek från isolerade RNA fotavtryck. Vi skisserar också RIPiT fördelar och tillämpningar och diskutera några av dess begränsningar.

En framgångsrik RIPiT kommer att resultera i immunoprecipitation av både proteiner av intresse och andra kända samverkande proteiner, och avsaknaden av icke-interagerande proteiner. Som framgår av figur 3Aupptäcktes både magoh och EIF4AIII i ripit-ELUERINGEN, men HNRNPA1 var inte (Lane 6). Samtidigt detekterades RNA-fotavtryck som har samrenat med RNP-komplexen via autoradiografi (figur 3B) eller bioanalyzer (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq at JoVE.com

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Identifiering av spår av RNA: protein komplex via RNA immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

Här presenterar vi ett protokoll för att berika endogena RNA bindningsställen eller "fotavtryck" av RNA: protein (RNP) komplex från däggdjursceller. Detta tillvägagångssätt innebär två immunoprecipitations av RNP subenheter och är därför dubbat RNA immunoprecipitation i tandem (ripit).

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

RNA-immunoprecipitation i tandem följt av sekvensering, eller RIPiT-Seq, är en metod för att identifiera vilka regioner av RNA som är bundna av ett visst par RNA-bindningsproteiner. Den mest unika fördelen med RIPiT är dess förmåga att rikta in sig på två olika proteiner i två reningar. Detta ger ett kraftfullt sätt att berika för ett kompositionsmässigt distinkt RNA-proteinkomplex från andra komplex.Dessutom är RIPiT-Seq UV-crosslinking oberoende, och kan appliceras på många proteiner som verkar på RNA utan att direkt binda den. Medan denna metod inte direkt sträcker sig mot terapi eller diagnos, RNA bindande proteiner och RNA bearbetning har associerats med flera sjukdomar som neuropatier och cancer. RIPiT-Seq tillhandahåller ett verktyg för att studera funktioner hos sjukdomsrelaterade RNA-bindningsproteiner.RIPiT-Seq kräver ett system där ett epitope-taggat protein kan uttryckas. Det har bara testats i HEK293 celler, och är mest mottagliga för cellkultur. Men nu med vår förmåga att märka proteiner med hjälp av CRISPR kan RIPiT-Seq vara tillämpligt på olika moderna system.Framgången för RIPiT beror på två effektiva immunoprecipitations, så det kommer att vara avgörande för att optimera immunoprecipitation villkor för den antikropp som används. Även att arbeta med RNA kräver ordentliga försiktighetsåtgärder, så RNase-fria reagenser bör användas under och efter RNA-extraktion. Att demonstrera proceduren blir Lauren Woodward, en doktorand i mitt labb.Börja med att tvätta monolayer celler försiktigt med 15 milliliter kyld PBS per 15 centimeter tallrik. Skrapa sedan av celler i 30 milliliter PBS och samla dem i ett 50 milliliter koniskt rör. Pellet cellerna genom centrifugering vid 400 g i 10 minuter vid 4 grader Celsius, och kasta supernatanten.Tillsätt fyra milliliter iskall hypotonisk lysbuffert och använd en P1000-pipett för att åter upphäva cellerna. Överför lysate till en fem milliliter tub och inkubera på is i 10 minuter. Placera lysate i ett isbad och sonikera enligt manuskriptriktningar.Tillsätt sedan 108 mikroliter av fem molarnatriumklorid för att justera saltkoncentrationen till 150 millimolar. Sedan centrifugera lysate på 12, 000 g i 10 minuter vid fyra grader Celsius, och samla 20 mikroliter av supernatant för västra blot analys. Pre-wash FLAG agarose pärlor enligt manuskriptet riktningar och tillämpa återstående supernatant till 750 mikroliter av pärlor i en fem milliliter rör.Inkubera FLAG agarose pärlor med cellextraktet i en till tre timmar vid fyra grader Celsius med mild blandning. Efter inkubation, pellet pärlorna genom centrifugeringen vid 400 g i en minut vid fyra grader Celsius, och samla 20 mikroliter av supernatanten för western blot analys. Kassera de återstående supernatant och tvätta pärlorna genom att resuspending dem i fyra milliliter iso tvätt buffert.Pellet pärlorna igen och ta bort supernatanten. Späd RNase I i 750 mikroliter av iso tvätt buffert enligt manuskriptet riktningar, och lägga till den i FLAG agarose pärlor. Inkubera blandningen i fyra grader Celsius med skonsam blandning, och sedan pellet pärlorna genom centrifugeringen.Samla 20 mikroliter av supernatant för western blot analys, och kassera resten. Tvätta sedan pärlorna med iso tvättbuffert som tidigare beskrivits. Därefter utför affinitet eluering genom att lägga till 375 mikroliter av elution buffert till pärlorna, och skaka blandningen försiktigt vid fyra grader Celsius i en till två timmar.Efter inkubation, pellet pärlorna och samla en 15 microliter aliquot av elueringen för västra blot analys. Medan affinitet eluering pågår, utföra magnetiska pärla antikroppar konjugation. Börja med att tvätta 50 mikroliter av magnetiska pärlor i en milliliter iso tvätt buffert.Resuspend pärlorna i 100 mikroliter av konjugation buffert och lägga till lämplig mängd antikroppar. Sedan, inkubera pärlorna i minst 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta de magnetiska pärlorna två gånger med konjugationsbuffert och resuspend pärlorna i 375 mikroliter av RIPiT-utspädningsbuffert.Förvara pärlorna på is tills immunoprecipitation. Applicera FLAG-tillhörighetseueringen på de antikropps kopplade magnetiska pärlorna och inkubera med skonsam blandning i en till två timmar vid fyra grader Celsius. Fånga de magnetiska pärlorna med en magnet och samla in 15 mikroliter av supernatant för western blot-analys.Sedan, tvätta pärlorna sju gånger med iso tvätt buffert. Fortsätt med denaturering eluering genom resuspending magnetiska pärlor i 100 mikroliter av klart prov buffert och inkubera suspensionen på is i 10 minuter. Under inkubationen, snärta regelbundet pärlorna för att återanvända dem.Fånga de magnetiska pärlorna på en magnet och samla 15 mikroliter av eluering för western blot analys. Överför återstående eluering till ett nytt 1,5 milliliterrör. För att extrahera RNA, tillsätt 320 mikroliter av RNase-fritt vatten och 400 mikroliter av fenol-kloroform isoamylalkohol till RIPiT elution.Vortexa blandningen och sedan centrifug den på 12, 000 g i fem minuter. Samla in 350 mikroliter av vattenfasen i ett separat rör. Tillsätt natriumacetat, magnesiumklorid, glykogen och etanol till det insamlade provet och inkubera blandningen över natten vid negativa 20 grader Celsius.Nästa dag, pellet RNA genom centrifugeringen vid 12, 000 g i 30 minuter vid fyra grader Celsius och tvätta den i 70%etanol. Efter etanoltvätten behandlar du RNA med T4 polynukleotidkinas, eller PNK, utan någon ATP, och utför fenol-kloroformrening enligt manuskriptriktningar. Resuspend den rena RNA i 4,5 mikroliter av RNase-fritt vatten.För att kvantifiera RNA-avkastning, radiolabel RNA:en med PNK och 32P märkta ATPs enligt manuskriptriktningar. Använd en låg räckvidd DNA stege och en 20 till 40 nukleotid syntetiska oligo för storlek och kvantitet standarder. Lös det märkta RNA på en 26%urea-polyakrylamide gel.Torka gelen enligt manuskriptriktningarna och utsätt gelen för en fosfoscreen tills tillräcklig signal detekteras. Denna teknik har använts för att undersöka interaktionerna mellan exon junction-komplexet eller EJC. Western blot analys av proteiner renas från varje större steg i RIPiT förfarandet visar att renad EJC innehåller både EIF4A3 och MAGOH.Den negativa kontrollen, HNRNPA1, detekteras inte i elueringen. Styrkan hos RNA-fotavtryckssignalen korrelerar med mängden RNA-proteininteraktion. Ett starkare fotavtryck observeras när RIPiT utfördes på celler som behandlats med puromycin, vilket ökar EJC-beläggningen på RNA.För att säkerställa att RIPiT har varit effektivt är det viktigt att testa effektiviteten i IP genom western blot. Det är också viktigt att bedöma mängden och kvaliteten på RNA innan du fortsätter med djup sekvensering. Under 2018 använde Singhlabbet framgångsrikt denna teknik för att rena två kompositionsskildiga varianter av exon-korsningskomplexet och identifiera RNA-bindningsmönster.Om forskare väljer att upptäcka RNA-avtryck med autoradiografi, bör alla ordentliga strålsäkerhetsrutiner och protokoll följas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Utredning av RNA-syntes med 5-Bromouridine märkning och Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Single-cell RNA Sequencing and Analysis of Human Pancreatic Islets

Enkelcellig RNA-sekvensering och analys av humana Pankreasöar

Pancreatic islets comprise of endocrine cells with distinctive hormone expression patterns. The endocrine cells show functional differences in response to ...

Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing

Identifiering av cirkulär RNAs med RNA-sekvensering

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs involved in functions including micro-RNA (miRNA) regulation, mediation of protein-protein ...

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomato Root Transformation Followed by Inoculation with Ralstonia Solanacearum for Straightforward Genetic Analysis of Bacterial Wilt Disease

Tomat rotomvandling följt av inokulering med Ralstonia Solanacearum för enkel genetisk analys av bakteriell vissna sjukdom

Ralstonia solanacearum is a devastating soil borne vascular pathogen that can infect a large range of plant species, causing an important threat to ...

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

Screening och identifiering av RNA-ljuddämpningssuppressorer från utsöndrade effektdämpare av växtpatogener

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

Transkriptom-Wide Profilering av protein-RNA interaktioner genom cross-linking och immunoprecipitation medierad av FLAG-Biotin Tandem Rening

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Upptäcka CsgD regulatoriska mål i salmonella biofilm med kromatin immunoprecipitation och högt dataflöde sekvensering (chip-SEQ)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...