Name: optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry
Uploaded: 2019-07-26T14:30:00
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作者要感谢EdStack,以前来自珀金埃尔默,他协助设置和优化原始多路复用染色。作者还希望感谢来自阿科亚生物科学的克里斯汀·施密特使用分析软件的提示。本出版物中报道的研究得到了国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592, K08CA201581(tlf),K08CA234222(js),R01CA15158807(mpm),RSG1417301CSM(mpm),R01CA19807403(mpm),U01CA22414501(mpm,hc),CA170568 (hc)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。杰弗瑞·科尔比结肠癌和汤姆·刘纪念研究基金提供了额外的支持。

所有工作都已获得密歇根大学内部审查委员会的批准。
1. 优化初级抗体和滑动制备
<ol><li>使用常规 IHC 确定多路复用抗体的理想浓度。<ol>
<li>通过手动常规免疫组织化学(IHC)13测试多路复用抗体。</li>
<li>使用具有丰富细胞类型的特定组织,用于测试的每个抗体,例如使用扁桃体组织进行CD3抗体测试。</li>
<li>使用公司推荐的IHC参考浓度,然后以推荐浓度的抗体浓?...

<ol>
	<li>Lazarus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+phenotypic+immune+profiling+of+metastatic+colon+cancer.">Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer.</a> JCI Insight. 3 (22), (2018).</li><li>Barua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Spatial+Analysis+Platform+for+Discovery+of+Immunological+Interactions+Predictive+of+Low-Grade+to+High-Grade+Transition+of+Pancreatic+Intraductal+Papillary+Mucinous+Neoplasms.">A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms.</a> Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).</li><li>Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+reveals+hyper+active+TGF-beta+signaling+in+colorectal+cancer.">Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer.</a> Cancer Biology &amp; Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).</li><li>Carstens, J. 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固体肿瘤活检和手术切除的结块组织标本仍然是疾病分析和患者预后的重要诊断和预测工具。多路复用荧光免疫组织化学(mfIHC)是一种将免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和流式细胞学的优点相结合的新技术。以前在原位探测细胞的方法允许评估细胞与细胞在组织环境中的排列8,然而,可探测的表位数量少限制了复杂的分析。流式细胞测定,虽然在分析标本中的许多细胞类型时很有用,?...

完整的肿瘤微环境(TME)的可视化对于评估固体恶性肿瘤中的细胞渗透以及细胞与细胞的相互作用至关重要。多路荧光免疫组织化学(mfIHC)已成为研究癌症和相关疾病1、2、3、4, 5,6,7.这与设计用于分析大型数据集的新型软件和程序相结合,能够观察单元1、2、4之间的复杂相互作用。数据采集中的速率限制因子通常是分析前染色组织的质量。
以前用于 TME 中表型细胞的技术包括免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF) 和流式细胞学,所有这些都存在重大限制。IHC使用形式固定石蜡嵌入(FFPE)组织部分,在被最常见的一种抗体染色之前,这些组织部分是去蜡化和再水化的。使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合二级抗体和化学反应允许可视化单个抗原表位8。虽然IHC是可靠的,并在FFPE组织上执行,这是容易使用,对可见光光谱的限制意味着只有一个或两个标记可以可靠地区分和共定位抗原相当困难8。扩展可用标记物,因此可在单个部分探测抗原的一种方法是更改为荧光,从而允许使用更广泛的视觉光谱。对于IF,冷冻或FFPE组织被转移到幻灯片上,并结合各种荧光团使用的抗体。虽然这会增加可以探测的抗原的数量,但有几个重要的局限性。首先,由于每个抗体通常只有一个荧光团,亮度通常不足以克服组织自荧光。正因如此,大多数IF是在冷冻组织上执行的,这种组织储存成本高昂,难以使用。由于光谱重叠和跨物种反应,可以使用数量有限的荧光标记,特别是在使用非结合抗体时。流动细胞学,包括新鲜组织加工成单个细胞悬浮液和荧光抗体标签,是免疫吸血功能的几十年9,10的黄金标准。流式细胞学的一个好处是能够标记多个抗体,而不必担心物种交叉反应,因为大多数是结合的。因为细胞是由机器而不是人眼"可视化"的,因此有更多的荧光道可用,但这样做是有代价的。补偿必须手动进行,这能显著改变产生假阳性和阴性群体的结果。流动细胞学的最大限制是组织架构和随后的所有空间信息因单细胞悬浮的必要性而丢失。
使用自动荧光显微镜与新型软件相结合的多路荧光免疫组织化学 (mfIHC) 结合了 IHC、IF 和流式细胞学的优点,允许多抗原组织染色,并实现信号扩增和无需补偿即可保留空间关系。FFPE组织被放置在带电的幻灯片上,在抗原检索后,对目标抗原进行一轮初级抗体应用,然后使用具有HRP化学标记的次级抗体,类似于IHC。放置二级抗体后,HRP特异性反应导致荧光团与兴趣表位11共价结合。一旦组织被标记,另一轮加热幻灯片完成删除先前应用的初级和二级抗体复合物只留下荧光标记绑定到组织表位11。这允许任何物种的多种抗体重新应用,而不必担心交叉反应11,12。为了尽量减少对多种荧光染料的人工补偿的需要,使用一组光谱重叠小(包括核计数器染色)的荧光光道来完成 mfIHC。为了考虑 FFPE 组织遇到的自荧光,软件使用空白幻灯片中的图像从最终图像中减去自荧光,这可能是由于荧光后抗原特异性荧光的强度信号放大。使用专为大型数据集设计的新型程序,可以识别和分析空间上下文1、2、4 的单元位置。该技术最大的限制是优化时间。此处提供了包含实验设计和染色和成像策略说明的详细方法。mfIHC 将可用于目前尚未优化的自动染色系统的实验室,该系统希望使用手动技术更好地了解完整 FFPE 组织中细胞与细胞间相互作用的空间环境。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC8001GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC10001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>HC11001GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS135783</td>
			<td>inForm version 2.3.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mountant</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36961</td>
			<td>ProLong Diamond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking solution</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SP-6000</td>
			<td>Bloxall</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-5E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Delicate task wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent diluent</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARD1A01EA</td>
			<td>Opal TSA diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 520</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 540</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1494001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 570</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 620</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 650</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1496001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore 690</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorophore DAPI</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>FP1490</td>
			<td>3 drops in TBST or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat resistant box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-904</td>
			<td>Plastic slide box-green</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Chamber</td>
			<td>Ibi Scientific</td>
			<td>AT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>FisherBiotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-4000</td>
			<td>ImmEdge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Mantra quantitative pathology workstation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-A661S</td>
			<td>with inverter technology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 6 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR600</td>
			<td>AR6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 9 antigen retrieval buffer</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>AR900</td>
			<td>AR9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP3994</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic slide box</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>25608-906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wrap</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9070936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-800</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD163</td>
			<td>Lecia</td>
			<td>NCL-LCD163</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0452</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody CD8</td>
			<td>Spring Bio</td>
			<td>M5390</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody FOXP3</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M3515</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody pancytokeratin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>12653</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody PD-L1</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>13684</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Opal polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide stain set</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>6254001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-012-CM</td>
			<td>TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical slide rack</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-294-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry

对完整组织进行微环境评估,用于分析细胞渗透和空间组织,对于了解疾病过程的复杂性至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光 (IF),这些技术能够使用 1 到 4 个标记将细胞可视化为快照。这两种技术都有缺点,包括难以染色不良的抗原靶点和与跨物种反应相关的局限性。IHC 是可靠和可重现的,但化学性质和对可见光光谱的依赖只允许使用几个标记,使共同本地化具有挑战性。使用IF拓宽了潜在的标记,但通常依赖于冷冻组织,由于形式固定后广泛的组织自荧光。流式细胞学,一种能够同时标记多个表位的技术,可消除IF和IHC的许多缺陷,然而,需要将细胞作为单个细胞悬浮液检查,从而失去了放弃重要生物的细胞的空间环境关系。多路复用荧光免疫组织化学 (mfIHC) 桥接这些技术,允许在形式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织中进行多表细胞表型,同时保留整体微环境架构和空间完整未破坏组织内细胞的关系。高荧光强度荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光 , 共价结合组织表位 , 使初级抗体的多种应用 , 而不必担心二次抗体的物种特异叉反应。尽管该技术已被证明能够产生可靠和准确的疾病研究图像,但由于广泛的优化和设计,创建有用的 mfIHC 染色策略的过程可能非常耗时且耗时。为了制作能够准确定位的细胞交互的可靠图像,并减轻手动分析的优化周期,这里介绍了用于幻灯片准备、优化抗体、多路复用设计以及错误的方法在染色过程中经常遇到。

获得 7 色多路测定的整个过程遵循重复模式。图 1以图表形式描述该过程。一旦幻灯片被切割和干燥,或从实验室收到,并在60°C的杂交炉中烘烤1小时,然后继续脱蜡和补液,修复幻灯片在形式再次,然后抗原检索。每一轮多路复用从抗原检索开始,在抗体去除时完成(图1)。
优化流程中的每个步骤对于实现清晰且可利用的图像至关重要。IHC...

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Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

多路荧光免疫组织化学是一项新兴技术,能够可视化完整形式固定的石蜡嵌入(FFPE)组织内的多种细胞类型。介绍了确保成功7色多路复用的指南,其中包含优化抗体和试剂、准备幻灯片、设计和避免常见问题的技巧的说明。

手动复用荧光免疫学的优化、设计和避免陷阱

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

多路复用荧光免疫组织化学可识别多种细胞类型及其在完整形式固定石蜡嵌入组织中的位置，不仅允许细胞识别，还允许细胞到细胞的空间分析。本手册技术的主要优点是使用同一物种的多种抗体，无需交叉反应。该技术可以深入了解肿瘤微环境中免疫细胞和癌细胞的相互作用。首次尝试此技术时，允许大约三到四天的染色，并在过程中完全跟踪每个步骤。染色过程和多路复用设计的较弱的方法对于减少常见和预期的陷阱至关重要。首先对幻灯片进行脱盐和重新加氢。将它们放在混合烤箱中，将组织侧向上，并在 60 摄氏度下烘烤一小时。将幻灯片从烤箱中取出，让其在垂直滑动架中冷却 5 到 10 分钟。然后使用幻灯片染色组，用二甲苯处理幻灯片三次，使用 100%乙醇、95% 乙醇和 70% 乙醇处理一次，每次处理 10 分钟。用去压水清洗幻灯片架，然后将滑梯淹没在中性缓冲形式中 30 分钟，以固定幻灯片。用水清洗幻灯片两分钟，然后进行抗原检索。将幻灯片架放入充满 pH 6.0 或 pH 9.0 抗原检索缓冲液的耐热盒中。用塑料包装盖住盒子，用橡皮筋固定。将盒子放入旋转板边缘配备逆变器的微波炉中，以 100% 功率加热幻灯片 45 秒，然后以 20% 功率加热 15 分钟。在微摇后，让幻灯片冷却 15 到 20 分钟。同时，准备抗体和荧光团的工作解决方案。在50毫升TBST或1X PBS中溶解0.5克牛血清白蛋白颗粒，准备原抗体稀释剂。将每个原抗体工作溶液稀释到先前确定的优化浓度。以1至100浓度稀释荧光团稀释荧光团。在染色的最后一天，通过将三滴 DAPI 添加到一毫升 TBST 中，准备 DAPI 工作解决方案。冷却幻灯片后，将其从微波炉中取下并取下塑料包装。用去维水洗涤两分钟，然后用 TBST 洗两分钟。洗涤后，用精细的任务擦拭和跟踪组织外方的滑轨，用疏水屏障笔擦拭和跟踪组织周围的滑轨，注意不要接触组织或让它干出来。将每个幻灯片放在加湿器室中，并在组织中加入大约四滴阻块溶液。然后在室温下孵育幻灯片10分钟，然后进行原抗体应用。通过敲击一叠纸巾上的幻灯片侧面，从每张幻灯片上拆下阻塞溶液，并使用精细的任务擦除来移除剩余的解决方案。将幻灯片放回加湿室，加入约200微升的工作原抗体，并孵育一小时。孵育后，将幻灯片淹没在 TBST 中两分钟，洗涤三次。从每张幻灯片上涂抹剩余的TBST，并应用大约三到四滴二级抗体。在加湿室中孵育幻灯片 10 分钟。使用 TBST 再次清洗幻灯片，并涂抹大约 100 微升的荧光冲洗工作溶液。将幻灯片返回加湿室并孵育 10 分钟。重复 TBST 洗涤，然后根据手稿指示微波幻灯片以去除抗体。在这个多天的染色过程中，要记住的一件重要的事情是在微摇步骤后停止，将幻灯片留在抗原检索缓冲液中过夜，确保组织和染色的完整性。用抗原检索溶液去除最后一个抗体应用，用去维水清洗幻灯片，然后每次洗涤用 TBST 洗两分钟。对抗体氟化物对的其余部分重复染色步骤，然后继续使用DAPI。将大约 150 微升的工作 DAPI 溶液涂抹到每张幻灯片上，并在加湿室中孵育 10 分钟。孵育后，用 TBST 清洗幻灯片约 30 秒，然后安装盖滑。安装介质干燥后，在盖滑的四角涂抹清晰的指甲抛光剂，以固定其。要分析单工，请使用 DAPI 对焦，以 250 毫秒的曝光在显微镜上对幻灯片进行图像成像。通过查看染色标记的荧光强度来评估每个单面幻灯片，并将此强度与背景进行比较。如果染色标记强度至少比背景高五倍，则在最后多路复用中使用滑动位置。染色多路复用时，为每个抗体选择适当的顺序，并将每个荧光团分配给抗体。继续按前面所述染色多路复用，并准备一张空白幻灯片，该幻灯片接收抗体稀释剂、荧光稀释剂和 TBST，而不是原抗体、荧光或 DAPI。当准备好在显微镜上成像多路复用时，将所有通道的曝光时间设置为 250 毫秒，并使用 DAPI 对焦捕获每个图像。然后使用分析软件通过荧光假色和病理学视图来评估每个多路复用，从而确认每个标记的特异性。为了确保多路复用测定的成功，必须进行单面测定以确定每种抗体的顺序。例如，当 Foxp3 处于阵列的第三位时，演示了使用 CD3 进行特定且坚固的染色和结肠化。相比之下，当 Foxp3 处于第一位置时，Foxp3 的非特异性染色发生。大多数幻灯片上都存在红色颗粒和有效区域，这些区域的荧光强度较低。此检测的另一个重要步骤是 DEPI 反污，这是细胞识别和进一步分析的基础。在具有工作和非工作 DAPI 的图像之间可以看到清晰的对比。对于多路复用检测，美丽的合成图像并不总是反映准确的污渍。CD3在可视化并显示特定染色时，CD163的病理亮场视图证明抗体是非特异性的。最佳多路复用图像演示复合图像中的特定染色，CD3 和 CD163 特异性与病理亮场视图确认。按照此过程，可以执行自表型和空间分析计算，以进一步分析细胞与细胞的相互作用。这项技术为研究人员探索细胞和完整组织的空间模式铺平了道路，进一步增进了我们对肿瘤免疫微环境的理解。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

科研

癌症研究

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

肿瘤靶向免疫调节副病毒的设计与评价

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...

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基于同步成像和流式细胞术检测治疗诱导的衰老癌细胞中的多种荧光衰老标志物

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ATAC-Seq Optimization for Cancer Epigenetics Research

用于癌症表观遗传学研究的ATAC-Seq优化

The assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) probes deoxyribonucleic acid (DNA) accessibility using the ...

肿瘤微环境的多重免疫荧光和空间图像分析

Multiplex Immunofluorescence Combined with Spatial Image Analysis for the Clinical and Biological Assessment of the Tumor Microenvironment

作者聚焦：多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床和生物学评估  

多重免疫荧光结合空间图像分析，用于肿瘤微环境的临床和生物学评估

The tumor microenvironment (TME) is composed of a plethora of different cell types, such as cytotoxic immune cells and immunomodulatory cells. Depending ...

使用 mIHC 破译肺鳞状癌中的肿瘤微环境

Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue

作者聚焦：增强肺癌样本中的多色荧光定位

石蜡包埋肺癌组织的多重免疫组化染色

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