Na biomassa lignocelulósica, a atividade das enzimas que analisam polissacarídeos é limitada pela existência de interações não específicas com a lignina. A análise fret é uma abordagem relevante para a evolução na escala nano. Obter todas as seções depois pode ser um desafio dependendo da biomassa.
Tome seu tempo fazendo a secção com o microtome e realize lavagens suaves. A colagem de medidas fluorescentes de vida e espectro permite uma determinação quantitativa sensível e inequívoca do FRET entre moléculas de lignina e TAG in situ. Este método emprega o uso de técnicas complicadas, como a seção de amostras na aquisição e análise de microscopia multidimensional que podem ser fáceis de aprender com uma demonstração visual.
Para preparar amostras de plantas de madeira, trigo, fibras ou fragmentos, use lâminas de barbear para cortar amostras de um centímetro de comprimento sem danificar a estrutura do material e colocar as amostras sob vácuo para remover qualquer ar. Submergir as amostras por 24 horas em sucessivas concentrações de 30% e 50% de PEG diluídas em água em temperatura ambiente com agitação suave. Seguido por 24 horas submerso em uma concentração de 100% de PEG a 70 graus Celsius.
Após a imersão de 100% PEG, coloque as amostras em cápsulas em uma placa quente de 70 graus celsius e diminua progressivamente a temperatura da placa em incrementos de cinco graus celsius até que a placa atinja a temperatura ambiente. Quando as amostras tiverem esfriado, use um microtome e lâminas descartáveis para obter cuidadosamente seções planas de 30 a 60 micrômetros de espessura de cada bloco PEG. Remova o PEG das seções com três lavagens suaves de cinco minutos.
Após a última lavagem, incubar até três seções por tubo com 500 microliters de sonda fluorescente recém-preparada por 72 horas protegidas da luz. No final da incubação de manchas, use um pincel para transferir as seções para um slide antes de montar as seções entre um slide de vidro e um deslizamento de cobertura número 1.5H. Para determinar a largura da janela espectral do detector sFLIM, coloque cristais de ureia em uma caixa de cultura com um fundo de vidro de 0,17 micrômetro e coloque a caixa em um suporte de amostra de microscópio.
Selecione o objetivo de 20X e um laser de safira dopado de titânio com um comprimento de onda de 900 nanômetros e 2% de potência e ligue a varredura. Para executar as medições sFLIM, mude o sistema para o modo sFLIM. Para coletar o segundo sinal harmônico no detector sFLIM, ajuste gradualmente o comprimento de onda de excitação a laser de 900 a 980 nanômetros até que o segundo sinal harmônico seja coletado no segundo canal espectral.
Em seguida, determine o comprimento da janela espectral. Mude para o modo não escaneado nãod para enviar fótons fluorescentes para o detector sFLIM. Defina a aquisição sFLIM para o modo habilitar para permitir que o fóton conte com o contador de fótons único.
Quando o instrumento estiver pronto, coloque uma seção de planta de trigo nativa de controle sozinha entre o slide e o deslizamento da tampa no estágio do microscópio e ajuste o sistema para o Modo Contínuo para permitir a varredura a laser. Estabeleça uma coleção de 30 segundos e verifique se a fração constante discriminatória é entre uma vez 10 a 10 e uma vez 10 para a sexta. Em seguida, selecione a área de medição na amostra e clique em Iniciar.
No final da medição, salve o arquivo sdt e repita a medição para pelo menos mais nove amostras. Deve-se encontrar um equilíbrio entre alcançar fótons coletados suficientes para o fóton, evitando a compra de pulso e efeitos induzidos por fotos que podem alterar a vida útil da florescence. Analise os dados sFLIM adquiridos, importe os arquivos de dados de palha de trigo nativo sozinho no software de contador de fótons único e abra opção e modo para selecionar nanosegundos Multinenciais Incompletos 12,5.
Em Opções e Preferências, selecione Calcular resposta instrumental automaticamente e selecione o modelo de ajuste exponencial. Para cada canal, aplique o modelo de encaixe e salve os parâmetros de ajuste em uma planilha. Para uma comparação entre os canais e experimentos, calcule a principal vida de fluorescência em uma planilha.
Para calcular a vida média de pelo menos 10 amostras em todos os canais, analise a principal vida fluorescente nos canais de doadores para determinar o valor do canal dedicado que escolheu o maior número de fótons e corresponde à emissão máxima de lignina. Para comparar os valores sFLIM e EFRET entre a amostra de palha de trigo nativa de controle e uma amostra experimental, considere um EFRET positivo associado a uma redução homogênea de vida entre o controle e as amostras experimentais a serem analisadas como um evento FRET. Neste experimento representativo, as curvas sFLIM mostram algumas das modificações que podem ser obtidas entre a amostra de referência e os dois casos de interação.
De fato, o aumento da fluorescência nas regiões espectrais correspondentes à faixa de emissão de Rhodamina é facilmente visualizado. Observação cuidadosa das três curvas de decaimento de fótons do primeiro canal, também revela uma inflexão mais forte para palha de trigo nativa com Dextrin marcado com Rhodamine, do que para palha de trigo nativa incubada com PEG marcado com Rhodamine. Depois de encaixar as curvas de decaimento de fótons e calcular cada tempo de vida de fluorescência principal do canal, a assinatura do FRET torna-se mais óbvia.
Por exemplo, enquanto o tempo de vida da fluorescência aumenta e diminui ao longo do espectro de fluorescência para a amostra de palha de trigo nativo, uma assinatura de FRET clara é observada para ambas as seções nativas de palha de trigo incubadas com PEG marcada com Rhodamine e palha de trigo nativa com dextrin marcado com amostras de Rhodamine. No contexto da hidrólise da biomassa lignocelulósica, esse método pode ser facilmente transferido para estudos de interação enzimática em várias amostras de biomassa que requerem uma caracterização rigorosa de cada nova biomassa. Uma vez que o sFLIM não requer fixação da amostra, abre caminho para estudos dinâmicos de interação com lignina enzimina e é provável que guie estratégias de engenharia de enzimas e pré-tratamentos de biomassa.
Como na maioria das vezes, as medições de tempo de vida requerem o uso de fontes de laser infravermelha de pulso. As precauções de segurança apropriadas devem ser tomadas em conformidade.
