Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

نشكر الدكتور دين براون على توفير مركبات من مكتبة أجزاء استرازينيكا والدكتور ديفيد باركين على توفير انزيمات AGNH و UNH. وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية للمعاهد الوطنية للصحة بموجب جائزة رقم R15AI128585 إلى B. J. S. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.كما تم دعم البحوث من قبل هوراس G. ماكدونيل زمالة البحوث الصيفية منحت لS. N. M., عائلة لاندسبرغ زمالة منحت لجي أ. ج.، ومنحة تطوير أعضاء هيئة التدريس وجائزة فريدريك بيتلهايم للأبحاث من جامعة أدلفي إلى ب. ج.

1. اختبار اختبار أولي اختبار اختبار اختبار في 500 μM و 250 μM
<ol><li>إعداد الركيزة ومركب الاختبار لردود الفعل.<ol>
<li>إعداد حلول المخزون من الركيزة (الأدينوسين أو 5-فلوروورديدين) في الماء و50 m مركب اختبار في ثنائي ميثيل سولفسيد deuterated (DMSO). راجع قسم المقدمة لتركيزات محلول الركيزة لاستخدامها.</li>
		<li>إضا?...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

البروتوكولات الموصوفة تنطبق عموما على العديد من الإنزيمات، شريطة أن تكون للركائز و/أو المنتجات إشارات قابلة للحل في طيف NMR. ومع ذلك، من الأهمية بمكان أن يكون تركيز الركيزة قريباً من قيمة Km وعالية بما يكفي للكشف في تجربة NMR ضمن إطار زمني معقول. تركيز الركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمةM</s...

التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) راسخ لتوصيف ورصد تفاعلات الإنزيم1،2. وتستخدم الاختلافات في التحولات الكيميائية وأنماط اقتران للتمييز بين الركيزة والرنين المنتج، وتستخدم كثافة الرنين النسبي لتحديد مقدار نسبة رد الفعل. ويلاحظ استهلاك الركيزة وابتكار المنتج مباشرة في طيف الـ NMR. وهذا يتناقض مع القياس الطيفي أو التحليل الطيفي للفلور، حيث يشار إلى مسار زمن التفاعل بتغيير في الامتصاص يعزى إلى بعض الأنواع الكيميائية التي يتم استهلاكها أو إنشاؤها. تماما كما هو الحال مع الطرق الأخرى، يمكن استخدام NMR لدراسة ردود فعل الإنزيم كدالة لدرجة الحرارة، ودرجة الألف، أو غيرها من شروط الحل، ويمكن تحديد آثار مثبطات.
في الآونة الأخيرة، تم إثبات فحوصات نشاط الإنزيم القائم على NMR لفحص الشظايا3و4. الاختبارات المستندة إلى NMR هي مناسبة بشكل مثالي للعمل في تركيزات أعلى من مركبات الاختبار (غالباما ما يصل إلى 1 mM) اللازمة للكشف عن هذه المثبطات أضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. ويقارن ذلك بشكل إيجابي باختبارات الطيف الطيفي حيث تنشأ مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات التشكيلات الجانبية المتداخلة للامتصاص فوق البنفسجي. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه الميزة يجعلها مفيدة كما الاختبارات متعامدة، واستكمال التقليدية عالية الإنتاجية فحص الاختبارات والفرز على مقاعد البدلاء5.
في مختبر البحوث لدينا، وتستخدم اختبارات النشاط القائم على NMR لتحديد وتقييم مثبطات تريتشوناز المهبلية النوكليوسيد الريبيوهيدرولاز. الطفيلي المهبلي T. يسبب المرض غير الفيروسي ة المنقولة جنسيا ً6. زيادة المقاومة للعلاجات القائمة7 هو الدافع للحاجة إلى علاجات جديدة، آلية القائم، مع الإنزيمات الأساسية مسار الإنقاذ النوكليوسيد تمثل الأهداف الرئيسية8. وقد تم تطوير اختبارات النشاط المستندة إلى NMR لكل من الإنزيمات الخاصة بالبيريميدين والبيورين، والريدين نوكليوسيد ريبوهيدرولاز (UNH)9، والأدينوسين / غوانوزين مفضلا النوكليوسيد ريبوهيدرولاز (AGNH)10. وترد ردود الفعل التي حفزت من قبل هذه الإنزيمات اثنين في الشكل 1. وتستخدم الاختبارات NMR لفحص مكتبات أجزاء لنقاط البداية الكيميائية، وتحديد قيم IC50، والازهاتمن مثبطات ربط التجميع أو التكافؤ 11 . ويجري أيضا ترجمة نفس الاختبارات لتقييم نشاط الإنزيم في الخلايا كلها12.
يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم يمكن أن يلاحظ فيه الركيزة والرنين المنتج ويميزه التحليل الطيفي NMR. وقد وضعت ثلاثة افتراضات للبساطة. أولاً، لم يتم تحديد الركيزة. وبالنسبة لفحوصات الأنشطة القائمة على معدل الوفيات الثلاثة لكي تكون مفيدة، ينبغي ألا يزيد التركيز النهائي للركيزة عن 2-3 x قيمة Km 4. في الأمثلة المعروضة، التركيزات النهائية من الأدينوسين و 5-فلورورين هو 100 ميكرومتر (ك = 54 ميكرومتر) و 50 ميكرومتر (ك = 15 ميكروم)، على التوالي. في البروتوكولات، وتحقيق هذه التركيزات يتوافق مع 12 μL من 5 m الأدينوسين أو 12 ميكرولتر من 2.5 mM 5-fluorouridine.
ثانياً، تم اختيار كمية الإنزيم المنصوص عليها في البروتوكولات، 5 μL، لتتوافق مع المبلغ المطلوب لينتج عن تحويل الركيزة إلى منتج بنسبة 75% تقريبًا في 30 دقيقة. هذه الكمية تمثل عادة تخفيفكبير من مخزون الإنزيم النقي، ويجب تحديد التخفيف مقدما لكل إنزيم. يتم تخزين حلول الإنزيم المنقي AGNH وUNH عند -80 درجة مئوية في الأليقوات التي توفر ما يكفي من الإنزيم لعدة آلاف من ردود الفعل. وبالتالي، فإن عامل التخفيف من الناحية المثالية يحتاج فقط إلى تحديد أو التحقق من صحته كل بضعة أشهر. ثالثاً، لم يتم تحديد تجربة NMR 1D المحددة. في النتائج التمثيلية، يظهر معدل1 H NMR لAGNH10 ويظهر 19F NMR لUNH9، مع تجربة NMR المذكورة في المراجع المقابلة. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة. وأخيراً، تجدر الإشارة إلى أن النهج التجريبي الموصوف لا يلتزم بالمتطلبات الصارمة للمعدل الكمّي (QNMR)13,14. في البروتوكول، يتم تحديد رد فعل النسبة المئوية باستخدام التغيرات النسبية في كثافة نفس الرنين في كل طيف، بدلا من تحديد التركيزات المطلقة. هذا النهج يلغي الحاجة إلى الحصول على البيانات وتعديلات المعالجة، فضلا عن المعايير الداخلية أو الخارجية، التي هي مطلوبة لqNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

وكثيراً ما يستخدم التحليل الطيفي لـ NMR لتحديد وتوصيف مثبطات الإنزيم في اكتشاف الأدوية، ولا سيما في سياق فحص الشظايا. وتختبر الاختبارات القائمة على النشاط القائم على معدل وفيات الوفيات الضعيفة بشكل مثالي للعمل في التركيزات الأعلى لمركبات الاختبار اللازمة للكشف عن هذه المثبطات الأضعف. يمكن للنطاق الديناميكي وتشتت التحول الكيميائي في تجربة NMR بسهولة حل الرنين من الركيزة والمنتج ومركبات الاختبار. وهذا يتناقض مع الاختبارات الطيفية، التي غالباً ما تنشأ فيها مشاكل تداخل القراءة من المركبات ذات الخصائص المتداخلة لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأنها تفتقر إلى الإنزيمات مراسل، واختبارات NMR الإنزيم واحد ليست عرضة للإيجابيات كاذبة مقرونة بالقياس. هذه السمة يجعلها مفيدة كاختبارات متعامدة، تكمل الاختبارات التقليدية عالية الإنتاجية الفحص واختبارات الفرز على مقاعد البدلاء. يتم توفير بروتوكولات مفصلة للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، وفحوصات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها. يتم عرض الأساليب باستخدام اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يظهر استخدام 1H NMR للإنزيم الخاص بالبيورين، في حين يظهر 19F NMR للإنزيم الخاص بالبيريميدين. تنطبق البروتوكولات بشكل عام على أي إنزيم حيث يمكن ملاحظة الركيزة والرنين المنتج وتمييزه بالتحليل الطيفي NMR. لتكون الأكثر فائدة في سياق اكتشاف المخدرات، يجب أن يكون التركيز النهائي للركيزة لا يزيد عن 2-3x قيمة Km. يعتمد اختيار تجربة NMR على تفاعل الانزيم وركائز المتاحة، فضلا عن الأجهزة NMR المتاحة.

ويبين الشكل 2 نتائج اختبار مركبين ضد الأنيه باستخدام معدل1 H NMR بعد القسم 1. وتفاعل الانزيم هو الأكثر سهولة وكمي ً ً باختفاء الأدينوسين وحيد والرنين المزدوج في 8.48 جزء في المليون و 6.09 جزء في المليون، على التوالي، وظهور الرنين الأدينين singlet في 8.33 جزء في المليون كما لوحظ في ...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR القائمة على تحليل النشاط لتحديد تثبيط مركب, قيم IC50, نشاط Artifactual, ونشاط الخلية الكاملة من النوكليوسيد الريبوهيدرولاسيس

وقد وضعت اختبارات النشاط القائمة على NMR لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات الريبوهيدرولاز النوكليوسيد. يتم توفير بروتوكولات للاختبارات المركبة الأولية في 500 ميكروم و 250 ميكرومتر، واختبارات استجابة الجرعة لتحديد قيم IC50، وفحوصات المنظفات المضادة للشاشة، واختبارات الشاشة المضادة لتخفيف القفزة، والفحوصات في الخلايا القولونية بأكملها.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

توفر مقايسات النشاط المستندة إلى NMR طريقة فعالة لتحديد وتقييم والتحقق من صحة مثبطات الإنزيم. وهي مناسبة بشكل خاص لفحص الشظايا. إن مقايسات NMR قابلة للتركيزات المركبة الأعلى المطلوبة لمثبطات الأضعف.بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود إنزيمات المراسل يجعلها أقل عرضة للايجابيات الكاذبة. نستخدم مقايسات NMR في مختبرنا لتحديد وتوصيف مثبطات اثنين من الإنزيمات من المهبل Trichomonas. كلا الإنزيمات تمثل أهدافا جديدة للأدوية المضادة للtrichomonal رواية.وMR المقاييس عموما تنطبق على أي مجال من مجالات البحوث التي تنطوي على الإنزيمات, ويمكن حتى أن تستخدم لدراسة الإنزيمات داخل الخلايا. أهم جوانب هذه التقنية هي التأكد من أن وحدات التخزين الكاشفة الصحيحة يتم مزجها بشكل دقيق ومكونات التفاعل. لإعداد الركيزة واختبار المركبات، إضافة 12 ميكرولترات من الركيزة إلى كل من أربعة أنابيب ميكروفروج 1.5 ملليلتر وإضافة ستة ميكرولترات من DMSO deuterated إلى التحكم لمدة صفر دقيقة وأنابيب التحكم لمدة 30 دقيقة.إضافة ستة ميكرولترات من مجمع الاختبار إلى أنبوب تجريبي الأول وثلاثة ميكرولترات من مجمع الاختبار وثلاثة ميكرولترات من DMSO deuterated إلى أنبوب تجريبي الثاني. بعد ذلك، أضف 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 2.59 ملليلتر من عازلة التفاعل، تليها 25 ميكرولترات من محلول الإنزيم. عكس بلطف أنبوب مرتين لمزيج رد فعل الأسهم حل وإضافة 10 ميكرولترات من 1.5 حمض الهيدروكلوريك المولر إلى أنبوب 1.5 ملليلتر تحتوي على 582 ميكرولترات من محلول الأسهم رد فعل.ثم، نقل كامل حجم رد فعل حل الأسهم وحمض إلى أنبوب التحكم في الدقيقة الصفر لبدء في وقت واحد وإرواء رد فعل التحكم في الدقيقة الصفر. التعرق والاستغناء عن العينة مرتين بطريقة بطيئة ولكن متعمدة. بدء وتشغيل ردود الفعل الثلاثة المتبقية بطريقة متداخلة، على الفور نقل 582 ميكرولترات من حل الأسهم رد فعل إلى أنبوب التجريبية الأولى وخلط العينة مرتين كما هو موضح للتو.ويضمن الطموح الدقيق والاستغناء خلط كامل خلال خطوات البدء. كن متناسقاً مع كل عينة لضمان أن الخلط التفاضلي ليس متغيرًا. بعد 30 ثانية، نقل 582 ميكرولترات من محلول الأسهم رد فعل إلى أنبوب التجريبية الثانية ومزيج، تليها إضافة 582 ميكرولترات أخرى من حل الأسهم رد فعل إلى أنبوب التحكم لمدة 30 دقيقة 30 ثانية بعد بدء التفاعل في أنبوب تجريبي الثاني.بعد 30 دقيقة، إضافة 10 ميكرولترات من حمض الهيدروكلوريك 1.5 مولر إلى الأنبوب التجريبي الأول، وتكرار التبريد على فترات 30 ثانية لأنابيب التحكم التجريبية الثانية و 30 دقيقة. عندما تم إخماد جميع ردود الفعل، نقل 600 ميكرولترات من الحل من كل رد فعل لأنابيب NMR. لحساب نسبة التحويل للركيزة لأطياف التحكم، قم بتحميل العينات على المطياف، وجمع أطياف NMR، وتراكب الأطياف لعناصر التحكم صفر و30 دقيقة.تحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة صفر لتطابق عنصر التحكم 30 دقيقة ولاحظ هذه النسبة المئوية. ثم، حساب التحويل النسبة المئوية كـ 100 ناقص النسبة المئوية من مطابقة إشارات الركيزة. لحساب نسبة التحويل في المئة من الركيزة لردود الفعل التي تحتوي على مجمع الاختبار، تراكب أطياف لمراقبة دقيقة الصفر وأول رد فعل يحتوي على مركب اختبار 500 ميكرومولار ومقياس إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة الصفر لتتناسب مع الطيف مع مجمع الاختبار.لاحظ هذه النسبة المئوية، واستخدمها لحساب نسبة التحويل كما هو موضح فقط. ثم تراكب الأطياف للتحكم في الدقيقة الصفرية والتفاعل الأول الذي يحتوي على مركب اختبار 250 ميكرومولار، وقم بتحجيم إشارة الركيزة في عنصر التحكم في الدقيقة الصفر لمطابقة الطيف مع مركب الاختبار. بعد الإشارة إلى النسبة المئوية، استخدمها لحساب النسبة المئوية للتحويل.لحساب نسبة التفاعل ونسبة التثبيط لكل تركيز مركب اختبار، أولاً، حساب نسبة التفاعل كتحويل النسبة المئوية لمركب الاختبار، مقسوماً على النسبة المئوية للتحويل من مرات التحكم 100. ثم حساب في المئة تثبيط 100 ناقص رد فعل في المئة. لإجراء فحص شاشة مضادة للمنظفات ، أضف 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم و 25 ميكرولترات من محلول الإنزيم إلى أنبوب 15 ملليلتر يحتوي على 2.59 ملليلتر من عازلة التفاعل.عكس بلطف أنبوب مرتين لخلط حل الأسهم رد الفعل، وإضافة اثنين من ميكرولترات من المنظفات تريتون X-100 إلى 20 ملليلتر من العازلة رد فعل. ثم، إضافة 2.59 ملليلتر من العازلة رد فعل، التي تحتوي على 0.01٪ تريتون X-100 المنظفات إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر جديدة. ثم إضافة 300 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم و 25 ميكرولترات من محلول انزيم إلى الأنبوب.عكس بلطف أنبوب مرتين لمزيج رد فعل الأسهم الحل. ثم، تحديد تثبيط في المئة لمركبات اختبار 100 ميكرومولار و 50 ميكرومولار كما هو موضح للتو. باستخدام محلول الأسهم رد فعل دون المنظفات، لمجموعة واحدة من أربعة أنابيب ومحلول الأسهم رد فعل مع المنظفات لمجموعة ثانية من أربعة أنابيب.لإجراء تخفيف القفز، ونقل 468 ميكرولترات من العازلة رد فعل و 60 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب يحتوي على 53.8 ميكرولترات من العازلة رد فعل، وخمسة ميكرولترات من محلول انزيم، و 1.2 ميكرولترات من DMSO التي تم احتضان لمدة 30 دقيقة. التعرق والاستغناء عن الخليط مرتين بطريقة بطيئة، ولكن متعمدة. قبل نقل 468 ميكرولتردات من العازلة رد فعل و 60 ميكرولترات من أكسيد الديوتريوم إلى أنبوب يحتوي على 53.8 ميكرولترات من العازلة رد فعل، وخمسة ميكرولترات من محلول انزيم، و 1.2 ميكرولترات من مجمع الاختبار الذي تم احتضان لمدة 30 دقيقة.اخلطي رد الفعل الثاني مرتين كما هو موضح. ونقل فورا 588 ميكرولتررس من الحل من أنبوب التحكم DMSO القفز- التخفيف إلى أنبوب يحتوي على 12 ميكرولترات من الركيزة مع الاختلاط. مواصلة نقل 588 ميكرولترتر من أنبوب مجمع اختبار القفز- التخفيف, أنبوب التحكم DMSO غير مخفف, واختبار غير مخفف أنبوب مركب إلى كل من ثلاثة 1.5 ملليلتر أنابيب, تحتوي على 12 ميكرولترات من الركيزة لكل أنبوب مع خلط على فترات 30 ثانية بعد ذلك.ثم انتظر 30 دقيقة قبل إخماد ردود الفعل، وجمع أطياف NMR، وحساب تثبيط في المئة لكل مركب كما أظهرت للتو. هنا تظهر نتائج اختبار مركبين ضد AgNH في اختبار مركب اختبار أولي باستخدام البروتون NMR كما هو مبين. ومن السهل ملاحظة رد فعل الإنزيم وتحديده كمياً باختفاء الرنين الأدينوسين المفرد والمزدوجة عند 8.48 و6.09 جزء لكل مليون على التوالي.وظهور مسكن أحادي الأدينين عند 8.33 جزء في المليون كما لوحظ في طيف التحكم لمدة 30 دقيقة. في هذا الشكل، تظهر نتائج اختبار مركب في تركيزين ضد AgNH في مقايسة مضادة للفحص المنظفات باستخدام البروتون NMR كما هو مبين. ويلاحظ فقط أدنى الاختلافات في كثافة الركيزة وإشارات المنتج باستخدام الشرطين، مما يشير إلى أن تثبيط الإنزيم الملاحظ ليس من الآثار المركبة التجميعية.لاحظ أن الرنين الناشئ عن المركب المختبر والمنظفات لا تتداخل مع الركازة أو صدى المنتج. نتائج اختبار مركب في اختبار القفز المخفف ضد AGNH باستخدام البروتون NMR كما هو موضح تكشف عن انخفاض كثافة إشارة الركيزة في تفاعل 20 ميكرومولار مقارنة برد فعل 200 ميكرومولار، مما يشير إلى أن تثبيط هو عكسها. عينة كاملة خلط أثناء بدء كل رد فعل وللورق القفزية أمر بالغ الأهمية.والمطلوب هو التطلع والاستغناء الدقيقين والثابتين. ويمكن أيضا أن تستخدم المقايسات المستندة إلى NMR لقياس نشاط الانزيم في الخلايا الكاملة، وذلك باستخدام محلول يحتوي على الخلايا المعلقة بدلا من العازلة رد الفعل والانزيم. جهودنا المضادة للثميرونية اكتشاف المخدرات لا تزال تعتمد على هذه المقايسات لقياس قوة المركبات المركبة حديثا توليفها ضد الانزيمات ريبوهيدرولاس.على الرغم من أنه يستخدم بكميات صغيرة جداً فقط، فإن حمض الهيدروكلوريك المستخدم لإخماد ردود الفعل خطير وينبغي استخدامه مع معدات الحماية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

ثابت للدولة، قبل المطرد للدولة، واحدة دوران قياس الحركية للنشاط الحمض النووي Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

نوكليوزيد Triphosphates - من توليف لتوصيف الكيمياء الحيوية

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

واللونية الفحص أن يقيس على وجه التحديد آخر باء granzyme متعلق ب التحلل البروتيني: التحلل من بوك علاء علاء-ASP-S-BZL

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylation فحوصات لكشف تفاعل بين Sirtuins (SIRT2) ومحددة البروتين ركائز

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

التوصيف، الكمي ومجمع محددة تحليل النظائر من مولد للحمى الكربون عن طريق البنزين كاربوكسيلية الأحماض (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

القائم HPLC الفحص لمراقبة خارج الخلية النكليوتيد / نوكليوزيد الأيض في خلايا سرطان الدم الليمفاوي المزمن الإنسان

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

البلاديوم<em&gt; N</em&gt; مجمعات كربينية هيتروكليكليك: توليف من أملاح بنزيميدازوليوم والنشاط الحفاز في التفاعلات تشكيل السندات الكربون الكربون

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

قياس واحد من HDAC1 والنشاط HDAC6 في الحلة الخلايا باستخدام أوهبلك--مرض التصلب العصبي المتعدد

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...