Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

我们感谢Dean Brown博士提供阿斯利康片段库中的化合物,感谢David Parkin博士提供AGNH和UNH酶。本出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持,奖励编号为R15AI128585至B.J.S.内容完全由作者负责,并不一定代表国家卫生研究院的官方观点。 研究还得到了霍勒斯·麦克唐纳暑期研究奖学金的支持,该奖学金授予了兰德斯伯格家族S.N.M.。奖学金授予J.A.G.,以及教师发展补助金和弗雷德里克·贝特尔海姆研究奖,从阿德菲大学授予B.J.S.

1. 500 μM和250 μM的初始测试化合物测定
<ol><li>准备基质和测试化合物以进行反应。<ol>
<li>在水和50 mM测试化合物中制备基质(腺苷或5-氟鲁丁)的原料溶液和脱硫二甲基硫酸盐(DMSO)中的50 mM测试化合物。有关要使用的基板溶液的浓度,请参阅简介部分。</li>
		<li>在四个 1.5 mL 微熔管中各加入 12 μL 的基板(腺苷或 5 氟鲁利丁),1⁄4。</li>
		<li>将 6 μL 的脱化 DMSO 添加到管 1(0 分钟控制)和 4(30 分钟控制)。在管2...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

所述协议通常适用于许多酶,前提是基质和/或产品在 NMR 频谱中具有可解析的信号。然而,基板的浓度必须接近其K m值,且足够高,足以在合理的时间范围内在NMR实验中检测到,这一点至关重要。基板浓度不高于K m值的2-3倍,是检测竞争、非竞争性和非竞争性抑制剂4的最佳值。如此处对 UNH 所示,基板Km值低至 15 μM 是合适的。使用带有CH3或CF<su...

核磁共振(NMR)光谱是公认的特征和监测酶反应1,2。化学移变和耦合模式的差异用于区分基板和产品共振,相对共振强度用于量化反应百分比。在NMR光谱中直接观察基板的消耗和产品的产生。这与分光光度或荧光光谱不同,在光谱中,反应时间过程由由于某些化学物种被消耗或产生的吸收力变化来指示。与其他方法一样,NMR 可用于研究酶反应作为温度、pH 或其他溶液条件的函数,并可以确定抑制剂的作用。
最近,基于NMR的酶活性测定已经用于片段筛选3,4。基于 NMR 的检测非常适合检测这些较弱抑制剂所需的较高浓度的测试化合物(通常高达 1 mM)。NMR 实验中的动态范围和化学移位色散可以很容易地解决基材、产品和测试化合物的共振。这与分光光度测定相比,光谱光度测定通常产生与紫外线吸收谱重叠的化合物的读出干扰问题。此外,由于它们缺乏报告酶,单酶NMR检测不易出现耦合检测假阳性。这一优势使它们作为正交测定非常有用,补充了传统的高通量筛选测定和台面分诊测定5。
在我们的研究实验室中,基于 NMR 的活动测定用于识别和评估阴道核苷核氢酶的三氯环比抑制剂。T. 阴道寄生虫引起最普遍的非病毒性传播疾病6.增加对现有疗法7的抗药性正在推动对新型机制治疗的需求,基本核苷抢救通路酶代表主要目标8。基于NMR的活性测定已经开发用于苯丙胺和紫基苯基特异性酶、尿苷核苷核糖酸酶(UNH)9和腺苷/瓜诺辛首选核苷核氢酶(AGNH)10。这两种酶催化的反应如图1所示。NMR检测用于筛选化学起始点的片段库,确定IC50值,并清除基于聚合或共价结合抑制剂11。同样的测定也被翻译来评估整个细胞的酶活性12。
为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查和大肠杆菌全细胞测定提供了详细的方案。这些协议通常适用于任何酶,其中基质和产品共振可以通过NMR光谱观察和区分。为简单起见,提出了三个假设。首先,未指定基板。对于基于 NMR 的活动测定有用的,基板的最终浓度不应超过Km值4的 2-3 倍。在所展示的示例中,腺苷和5-氟鲁里丁的最终浓度分别为100μM(Km =54 μM)和50μM(Km = 15 μM)。在协议中,达到这些浓度对应于12 μL的5 mM腺苷或12μL的2.5 mM 5氟鲁里丁。
其次,选择协议中规定的酶量5μL,与在30分钟内使基质转化为产品所需的量相对应。此数量通常表示纯化酶库存的较大稀释,并且必须提前确定每种酶的稀释。纯化的AGNH和UNH酶储存溶液储存在-80°C的等分中,为数千次反应提供足够的酶。因此,稀释因子理想情况下只需要每隔几个月确定或验证一次。第三,未指定特定的 1D NMR 实验。在代表性结果中,为AGNH10显示1H NMR,为UNH9显示19FNMR,并在相应的参考中描述了NMR实验。NMR 实验的选择取决于可用的酶反应和基质以及可用的 NMR 仪器。最后,应该指出,所述的实验方法不符合定量NMR(qNMR)13、14的严格要求。在协议中,使用每个光谱中相同共振强度的相对变化,而不是通过确定绝对浓度来确定百分比反应。此方法消除了数据采集和处理修改以及 qNMR 所需的内部或外部标准的需求。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR光谱学通常用于药物发现中酶抑制剂的鉴定和表征,特别是在片段筛选方面。基于 NMR 的活性测定非常适合在检测这些较弱抑制剂所需的较高浓度的测试化合物下工作。NMR 实验中的动态范围和化学移位分散可以很容易地解决基材、产品和测试化合物的共振。这与分光光度测定形成对比,在分光光度测定中,读出干扰问题通常产生于具有重叠的UV-对吸收谱的化合物。此外,由于它们缺乏报告酶,单酶NMR检测不易出现耦合检测假阳性。此属性使它们作为正交测定非常有用,补充了传统的高通量筛选测定和台面分诊测定。为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查和大肠杆菌全细胞测定提供了详细的方案。使用两种核苷核氢酶演示了该方法。显示1 HNMR 用于纯素特异性酶,而19F NMR 用于苯丙胺特异性酶。这些协议通常适用于任何酶,其中基质和产品共振可以通过NMR光谱观察和区分。为了在药物发现方面最有用,基质的最终浓度不应超过其K m值的2-3倍。NMR 实验的选择取决于可用的酶反应和基质以及可用的 NMR 仪器。

图 2显示了在第 1 节之后使用1 HNMR 对 AGNH 测试两种化合物的结果。酶反应最容易观察到和量化,分别于8.48 ppm和6.09 ppm的腺苷单次共振和双子共振的消失,以及30分钟对照中观察到的8.33 ppm腺苷单次共振的出现谱。在存在500μM化合物1的情况下,没有形成任何产物,在8.33 ppm时缺乏脱位共振就证明了这一点。在存在250μM化合物1的情况下,大约10%的基板已转化为产品。相比之下,?...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

基于NMR的活性测定,用于测定核苷裂解酶的化合物抑制、IC50值、伪影活性和全细胞活性

基于NMR的活性测定已经开发出来,以识别和表征两种核苷糖酶的抑制剂。为500μM和250μM的初始化合物测定、确定IC50值的剂量反应测定、洗涤剂计数器屏幕测定、跳跃稀释计数器筛查测定以及大肠杆菌全细胞测定提供了协议。

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

基于 NMR 的活动测定为识别、评估和验证给定酶的抑制剂提供了一种有效的方法。它们特别适合片段筛选。NMR测定适合较弱抑制剂所需的较高化合物浓度。此外，记者酶的缺乏使他们不容易出现假阳性。我们使用实验室中的 NMR 测定来识别和鉴定来自 Trichomonas 阴道的两种酶的抑制剂。这两种酶代表了新型抗三氯一酸药物的新靶点。NMR测定通常适用于任何涉及酶的研究领域，甚至可用于研究细胞内的酶。该技术最重要的方面是确保正确的试剂体积被移液，反应成分被彻底混合。要准备基板和测试化合物，在四个 1.5 毫升微模糊管中每个管中加入 12 微升基板，并在零分钟控制和 30 分钟控制管中加入 6 微升的脱气 DMSO。在第一个实验管中加入6微升试验化合物，在第二个实验管中加入3微升试验体，将3微升除臭DMSO。接下来，在含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升管中加入300微升的氧化铝，然后是25微升的酶溶液。轻轻反转管两次，混合反应库存溶液，并在含有582微升反应库存溶液的1.5毫升管中加入10微升1.5摩尔盐酸。然后，将反应库存溶液和酸的整个体积转移到零分钟控制管中，同时启动和淬火零分钟控制反应。以缓慢但深思熟虑的方式吸气和分配样品两次。以交错的方式启动并运行其余三种反应，立即将反应存量溶液的 582 微升转移到第一个实验管中，并将样品混合两次，正如刚刚演示的一样。仔细的吸气和点胶可确保在启动步骤中完全混合。与每个样品保持一致，确保差分混合不是变量。30秒后，将582微升反应存量溶液转移到第二实验管并混合，然后在第二实验管中启动反应后30秒内再将582微升反应存量溶液转移到30分钟控制管。30分钟后，在第一个实验管中加入10微升1.5摩尔盐酸，以30秒的间隔重复淬火，第二个实验管和30分钟控制管。当所有反应都淬火后，将600微升溶液从每次反应转移到核磁共振管。要计算控制光谱基板的百分比转换，请将样品加载到光谱仪上，收集 NMR 光谱，并覆盖零和 30 分钟对照的光谱。在零分钟控制中缩放基板信号以匹配 30 分钟控制并注意此百分比。然后，将转换百分比计算为 100 减去基板信号匹配中的百分比。要计算包含测试化合物的反应基板的百分比转换，将零分钟控制光谱和包含500微摩尔试验化合物的第一反应覆盖，并在零分钟控制中缩放基板信号，使光谱与测试化合物相匹配。请注意此百分比，并使用它计算刚才演示的转化百分比。然后，覆盖零分钟控制和包含250微摩尔试验化合物的第一反应的光谱，并在零分钟控制中缩放基板信号，使光谱与测试化合物相匹配。注意到百分比后，使用它来计算转化百分比。要计算每个试验化合物浓度的百分比反应和百分比抑制率，首先，计算百分比反应作为测试化合物的百分比转换，除以控制时间 100 的百分比转换。然后将百分比抑制计算为 100 减去百分比反应。要进行洗涤剂计数器筛选检测，在含有2.59毫升反应缓冲液的15毫升管中加入300微升的氧化铝和25微升的酶溶液。轻轻反转管两次，混合反应库存溶液，并在20毫升的反应缓冲液中加入两个Triton X-100洗涤剂的微升。然后，将含有 0.01% Triton X-100 洗涤剂的反应缓冲液加入 2.59 毫升的反应缓冲液，加入新的 15 毫升锥形管中。然后加入300微升的氧化铝和25微升的酶溶液到管中。轻轻反转管两次，混合反应库存溶液。然后，确定100微摩尔和50微摩尔试验化合物的百分比抑制率，正如刚刚证明的。使用不带洗涤剂的反应库存溶液，用于一组四管和反应库存溶液与洗涤剂一对四管。为了进行跳跃稀释，将468微升的反应缓冲液和60微升的氧化铝转移到含有53.8微升反应缓冲液、5微升酶溶液和1.2微升的DMSO的管中，这些微升已经孵育了30分钟。以缓慢但深思熟虑的方式吸气和分配混合物两次。在将468微升反应缓冲液和60微升的氧化铝转移到含有53.8微升反应缓冲液的管中之前，将5微升酶溶液和1.2微升的试验化合物孵育30分钟。如所证明，将第二反应混合两次。并立即将588微升溶液从跳波稀释DMSO控制管转移到含有12微升基板的管中进行混合。继续将 588 微升从跳波稀释试验复合管、未稀释的 DMSO 控制管和未稀释的试复合管转移到三个 1.5 毫升管中，每个管包含 12 微升基板，此后每隔 30 秒进行混合。然后等待30分钟，然后淬火，收集N NMR光谱，并计算每个化合物的百分比抑制率，正如刚才证明的。这里显示了在使用质子 NMR 的初始测试化合物检测中对 AgNH 测试两种化合物的结果。酶反应最易观察到和量化的腺苷单和双核共振的消失分别为8.48和6.09百万分之一。和腺素单居的外观在百万分之8.33的30分钟控制光谱中观察到。在图中，在使用质子 NMR 的洗涤剂反筛选检测中，对 AgNH 的两种浓度的化合物进行检测的结果如图所示。使用这两个条件，在基板和产品信号的强度中只观察到最小的差异，表明观察到的酶抑制不是化合物聚集的神器。请注意，经测试的化合物和洗涤剂产生的共振不会干扰基板或产品共振。使用质子 NMR 对 AGNH 进行跳稀释测定的化合物测试结果表明，与 20 微摩尔反应相比，20 微摩尔反应中基底信号的强度降低，表明抑制是可逆的。在每次反应开始和跳跃稀释过程中进行完整的样品混合至关重要。需要仔细和一致的愿望和点胶。基于 NMR 的测定也可用于测量整个细胞中的酶活性，使用含有悬浮细胞的溶液代替反应缓冲液和酶。我们的抗三氯monal药物发现工作继续依靠这些测定来测量新合成化合物对核氢酶的功效。即使只使用很少数量，用于淬火反应的盐酸也是危险的，应与适当的个人防护设备一起使用。

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

稳态，稳定前的状态，单营业额动力学测量DNA糖基化酶活性

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

科研

化学

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

通过荧光基冰平面亲和力确定防冻蛋白的冰结合平面

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

核苷三磷酸 - 从合成到生化特征

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

PAD4活动通过亲荧光底物类似物基于荧光监测

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

比色测定的具体措施颗粒酶B蛋白水解活动：水解的Boc-丙氨酸 - 丙氨酸-ASP-S-BZL的

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

脱乙酰测定解开蛋白特异底物乙酰化酶之间的Interplay（SIRT2）和

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

表征，气相炭用苯聚羧酸的定量和特定化合物同位素分析（BPCA）

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-基于化验，以监测外核苷酸/核苷代谢的人类慢性淋巴细胞白血病细胞

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

钯<em&gt;ñ</em&gt; - 杂环碳烯配合物：苯并咪唑盐的合成和碳 - 碳键合反应中的催化活性

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

同时测量 HDAC1 和 HDAC6 活动在 HeLa 细胞使用 UHPLC 女士

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...