Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Vi takker Dr. Dean Brown for at levere forbindelser fra AstraZenecas fragment bibliotek og Dr. David Parkin for at levere AGNH-og UNH-enzymerne. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of allergi og smitsomme sygdomme af de nationale institutter for sundhed under Award nummer R15AI128585 til B. J. S. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale institutter for sundhed. Research blev også støttet af en Horace G. McDonell Summer Research Fellowship tildelt S. N. M., en Landesberg familie Stipendium tildelt til J. A. G. og Fakultets Udviklingsstipendier og Frederick Bettelheim Research Award fra Adelphi University til B. J. S.

1. indledende test sammensatte analyser ved 500 μm og 250 μm
<ol><li>Forbered substrat og teststof til reaktioner.<ol>
<li>Forbered stamopløsninger af substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vand og 50 mM test forbindelse i deutererede dimethylsulfoxid (DMSO). Se introduktions afsnittet for koncentrationer af substratopløsning, der skal anvendes.</li>
		<li>Der tilsættes 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) til hver af de fire 1,5 mL microfuge Tubes, 1 – 4.</li>
		<li>Tilsæt 6 μL deutereret DMSO ...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

De beskrevne protokoller gælder generelt for mange enzymer, forudsat at substrater og/eller produkter har afvikles signaler i NMR-spektret. Men det er afgørende, at koncentrationen af substrat er tæt på sin Km værdi og høj nok til at blive opdaget i en NMR eksperiment inden for en rimelig tidsramme. En substratkoncentration, der ikke er højere end 2-3x Km -værdien, er optimal til påvisning af konkurrencedygtige, ikke-konkurrencedygtige og ukompetitive inhibitorer<sup class...

Nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er veletableret til karakterisering og overvågning af enzymreaktioner1,2. Forskelle i kemiske forskydninger og koblings mønstre bruges til at skelne mellem substrat-og produkt resonanser, og relative resonans intensiteter bruges til at kvantificere procentdelen af reaktionen. Både forbruget af substrat og skabelsen af produktet er direkte observeret i NMR spektrum. Dette står i kontrast til spektrofotomometri eller fluorescens spektroskopi, hvor reaktionstiden indikeres ved en ændring i absorbans, der kan tilskrives visse kemiske arter, der forbruges eller dannes. Ligesom med de andre metoder, NMR kan bruges til at studere enzymreaktioner som en funktion af temperatur, pH, eller andre løsning betingelser, og virkningerne af inhibitorer kan bestemmes.
For nylig er der påvist NMR-baserede enzym aktivitetsassays for fragment screening3,4. NMR-baserede analyser er velegnet til at arbejde ved de højere koncentrationer af test forbindelser (ofte så høje som 1 mm), der kræves for at detektere disse svagere inhibitorer. Det dynamiske område og den kemiske Skift dispersion i NMR-eksperimentet kan nemt løse resonanser fra substrat-, produkt-og test forbindelser. Dette kan sammenlignes positivt med spektrofotometriske analyser, hvor der ofte opstår problemer med udlæsning af interferens fra forbindelser med overlappende UV-Vis-absorptions profiler. Desuden, da de mangler reporter enzymer, de enkelt-enzym NMR-analyser er ikke tilbøjelige til at koblet-assay falske positiver. Denne fordel gør dem nyttige som ortogononale analyser, der supplerer traditionelle højt gennemløb screening analyser og stationære triage analyser5.
I vores forskningslaboratorium anvendes NMR-baserede aktivitets analyser til at identificere og evaluere inhibitorer af Trichomonas vaginalis nukleosid-ribohydrolaser. Den T. vaginalis parasit forårsager den mest udbredte ikke-viral seksuelt overførte sygdom6. Stigende resistens over for eksisterende terapier7 driver behovet for nye, mekanisme baserede behandlinger, med essentielle nukleosid bjærgnings pathway enzymer, der repræsenterer primære mål8. Der er udviklet NMR-baserede aktivitets analyser for både pyrimidin-og purin-specifikke enzymer, uridine nucleosid ribohydrolase (unh)9og adenosin/guanosin foretrækker nukleosid ribohydrolase (agnh)10. De reaktioner, der katalyseres af disse to enzymer, er vist i figur 1. NMR-analyser bruges til at screene fragment biblioteker for kemiske udgangspunkter, bestemme IC50 -værdier og frasortere aggregerings baserede eller kovalente bindings inhibitorer11. De samme analyser er også ved at blive oversat til at vurdere enzymaktivitet i hele cellerne12.
Detaljerede protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Protokollerne er generelt gældende for ethvert enzym, hvor substrat og produkt resonanser kan observeres og skelnes fra NMR spectroscopy. Tre antagelser er blevet gjort for enkelhed. For det første er substratet ikke specificeret. For NMR-baserede aktivitet analyser at være nyttig, den endelige koncentration af substrat bør ikke være mere end 2-3x Km værdi4. I de viste eksempler er de endelige koncentrationer af adenosin og 5-fluorouridin 100 μM (km = 54 μM) og 50 μm (km = 15 μm) hhv. I protokollerne svarer opnåelsen af disse koncentrationer til 12 μL 5 mM adenosin eller 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridin.
For det andet blev den mængde enzym, der er fastsat i protokollerne, 5 μL, valgt til at svare til den mængde, der kræves for at resultere i ca. 75% omdannelse af substrat til produkt i 30 min. Denne mængde repræsenterer typisk en stor fortynding fra en renset enzym bestand, og fortyndingen skal bestemmes på forhånd for hvert enzym. Rensede AGNH-og UNH-enzym stamopløsninger opbevares ved-80 °C i aliquoter, der giver nok enzym til flere tusinde reaktioner. Fortyndingsfaktoren skal derfor ideelt set kun bestemmes eller valideres hvert par måneder. For det tredje er den specifikke 1D NMR eksperiment ikke specificeret. I de repræsentative resultater, 1h NMR er vist for agnh10 og 19F NMR er vist for unh9, med NMR eksperiment beskrevet i de tilsvarende referencer. Valget af NMR eksperiment afhænger af enzymreaktionen og substrater til rådighed samt tilgængelige NMR Instrumentation. Endelig skal det påpeges, at den beskrevne eksperimentelle fremgangsmåde ikke overholder de strenge krav til kvantitative NMR (qnmr)13,14. I protokollen, en procent reaktion bestemmes ved hjælp af de relative ændringer i intensiteten af samme resonans i hvert spektrum, snarere end ved at bestemme absolutte koncentrationer. Denne fremgangsmåde eliminerer behovet for dataindsamling og behandling ændringer samt interne eller eksterne standarder, som er nødvendige for qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR spectroskopi anvendes ofte til identifikation og karakterisering af enzyminhibitorer i lægemiddel opdagelse, især i forbindelse med fragment screening. NMR-baserede aktivitet analyser er velegnet til at arbejde på de højere koncentrationer af test forbindelser, der kræves for at påvise disse svagere hæmmere. Det dynamiske område og den kemiske Skift dispersion i et NMR-eksperiment kan nemt løse resonanser fra substrat-, produkt-og test forbindelser. Dette står i kontrast til spektrofotometriske analyser, hvor der ofte opstår problemer med udlæsning af interferens fra forbindelser med overlappende UV-Vis-absorptions profiler. Desuden, da de mangler reporter enzymer, de enkelt-enzym NMR-analyser er ikke tilbøjelige til at koblet-assay falske positiver. Denne attribut gør dem nyttige som ortogononale analyser, der supplerer traditionelle højt gennemløb screening analyser og stationære triage analyser. Detaljerede protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Metoderne påvises ved hjælp af to nukleosid-ribohydrolase-enzymer. Brugen af 1H NMR er vist for det purine-specifikke enzym, mens 19F NMR er vist for det pyrimidinspecifikke enzym. Protokollerne er generelt gældende for ethvert enzym, hvor substrat og produkt resonanser kan observeres og skelnes fra NMR spectroscopy. For at være den mest nyttige i forbindelse med narkotika opdagelse, bør den endelige koncentration af substrat ikke være mere end 2-3x sin Km værdi. Valget af NMR eksperiment afhænger af enzymreaktionen og substrater til rådighed samt tilgængelige NMR Instrumentation.

Figur 2 viser resultaterne for afprøvning af to forbindelser mod agnh ved hjælp af 1H NMR efter punkt 1. Enzymet reaktion er lettest observeret og kvantificeret ved forsvinden af adenosin singlet og tvivlet resonanser på 8,48 ppm og 6,09 ppm, henholdsvis, og udseendet af en adenin singlet resonans ved 8,33 ppm som observeret i 30 min kontrol Spektrum. Ved tilstedeværelse af 500 μM sammensatte 1 dannes der ikke noget produkt, som det fremgår af manglen på en adenin resonans ...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-baserede Aktivitetsassays til bestemmelse af sammensatte hæmning, IC50 -værdier, artifaktuel aktivitet og helcelle aktivitet af Nukleosid-Ribohydrolaser

Der er udviklet NMR-baserede aktivitets analyser for at identificere og karakterisere inhibitorer af to nukleosid-ribohydrolase-enzymer. Protokoller er fastsat for indledende sammensatte analyser på 500 μm og 250 μm, dosis-respons analyser til bestemmelse af IC50 værdier, vaskemiddel tæller skærm analyser, hoppe-fortynding Counter skærm analyser, og analyser i E. coli hele celler.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR-baserede aktivitetsanalyser giver en effektiv metode til at identificere, evaluere og validere inhibitorer for et givet enzym. De er særligt velegnede til fragmentscreening. NMR-analyser kan henføres til de højere sammensatte koncentrationer, der kræves for svagere inhibitorer.Desuden gør manglen på reporterenzymer dem mindre tilbøjelige til falske positiver. Vi bruger NMR-analyserne i vores laboratorium til at identificere og karakterisere hæmmerne af to enzymer fra Trichomonas vaginalis. Begge enzymer repræsenterer nye mål for nye anti-trikolmonale lægemidler.NMR-analyserne gælder generelt for ethvert forskningsområde, der involverer enzymer, og de kan endda bruges til at studere enzymerne inde i cellerne. De vigtigste aspekter af teknikken er at sikre, at de korrekte reagensmængder pipetteres, og at reaktionskomponenterne blandes grundigt. For at forberede substrat og testforbindelser, tilsættes 12 mikroliter af substrat til hver af fire 1,5-milliliter mikrofuge rør og tilføje seks mikroliter af deuterated DMSO til nul-minutters kontrol og 30-minutters kontrolrør.Der tilsættes seks mikroliter af teststoffet til det første forsøgsrør og tre mikroliter af teststoffet og tre mikroliter deutereret DMSO til det andet forsøgsrør. Dernæst tilsættes 300 mikroliter deuteriumoxid til et 15-milliliterrør indeholdende 2,59 milliliter reaktionsbuffer efterfulgt af 25 mikroliter enzymopløsning. Inverter forsigtigt røret to gange for at blande reaktionsbestandopløsningen, og der tilsættes 10 mikroliter 1,5 molarchlorsyre til et 1,5 milliliterrør indeholdende 582 mikroliter reaktionslageropløsning.Derefter overføres hele volumen af reaktionsstrømopløsning og syre til nul-minutters kontrolrøret for samtidig at starte og slukke nul-minutters kontrolreaktionen. Aspirerende og dispensering af prøven to gange på en langsom, men bevidst måde. Start og kør de resterende tre reaktioner på forskudt måde, og overførsel straks 582 mikroliter af reaktionslageropløsningen til det første forsøgsrør og blanding af prøven to gange som netop påvist.En omhyggelig aspiration og dispensering sikrer en komplet blanding under initieringstrinene. Vær i overensstemmelse med hver prøve for at sikre, at differentialblanding ikke er en variabel. Efter 30 sekunder overføres 582 mikroliter af reaktionsstrømopløsning til det andet forsøgsrør og blandes, efterfulgt af tilsætning af yderligere 582 mikroliter af reaktionsstrømopløsning til 30-minutters kontrolrøret 30 sekunder efter påbegyndelse af reaktionen i det andet forsøgsrør.Efter 30 minutter tilsættes 10 mikroliter 1,5-molarchlorsyre til det første forsøgsrør, og dæmpningen gentages med 30 sekunders intervaller for det andet forsøgs- og 30-minutters kontrolrør. Når alle reaktionerne er slukket, overføres 600 mikroliter opløsning fra hver reaktion til NMR-rør. For at beregne procentkonverteringen af substratet for kontrolspektrene skal prøverne indlæses på spektrometeret, NMR-spektreen indsamles og overlejrer spektre for nul- og 30-minutters kontrollerne.Skaler substratesignalet i nul-minutters kontrolelementet, så det svarer til 30-minutters kontrollen, og bemærk denne procentdel. Beregn derefter procentkonverteringen som 100 minus procentdelen fra matchningen af substratsignalerne. For at beregne procentkonverteringen af substratet for de reaktioner, der indeholder teststoffet, overlejre spektre for nul-minutters kontrol og den første reaktion, der indeholder 500-mikromolar testforbindelse og skalere substrat signalet i nul-minutters kontrol til at matche spektret med teststoffet.Bemærk denne procentdel, og brug den til at beregne procentkonverteringen som netop demonstreret. Derefter overlejre spektre for nul-minutters kontrol og den første reaktion, der indeholder 250-mikromolære test sammensatte, og skalere substrat signalet i nul-minutters kontrol til at matche spektret med teststoffet. Når du har notere procentdelen, skal du bruge den til at beregne procentkonverteringen.For at beregne procentreaktion og procent hæmning for hver test sammensat koncentration, først, beregne procent reaktion som procent konvertering af testforbindelsen, divideret med den procentvise konvertering af kontrol gange 100. Derefter beregnes procenthæmning som 100 minus procentreaktionen. For at udføre en vaskemiddeltælleranalyse tilsættes 300 mikroliter deuteriumoxid og 25 mikroliter enzymopløsning til et 15 milliliterrør indeholdende 2,59 milliliter reaktionsbuffer.Inverter forsigtigt røret to gange for at blande reaktionslageropløsningen, og der tilsættes to mikroliter Triton X-100-vaskemiddel til 20 milliliter reaktionsbuffer. Derefter tilsættes 2,59 milliliter reaktionsbuffer, der indeholder 0,01% Triton X-100 vaskemiddel til et nyt 15-milliliter konisk rør. Derefter tilsættes 300 mikroliter deuteriumoxid og 25 mikroliter enzymopløsning til røret.Inverter forsigtigt røret to gange for at blande reaktionslageropløsning. Derefter, bestemme procent hæmning for 100-mikromolar og 50-mikromolar testforbindelser som netop påvist. Ved hjælp af reaktionsopbestæringen uden vaskemiddel til et sæt af fire rør og reaktionslageropløsningen med vaskemiddel i et andet sæt af fire rør.For at udføre en jumpfortynding overføres 468 mikroliter af reaktionsbuffer og 60 mikroliter deuteriumoxid til et rør, der indeholder 53,8 mikroliter reaktionsbuffer, fem mikroliter enzymopløsning og 1,2 mikroliter AF DMSO, der er inkuberet i 30 minutter. Aspirere og dispensere blandingen to gange i en langsom, men bevidst måde. Før 468 mikroliter af reaktionsbuffer og 60 mikroliter deuteriumoxid overføres til et rør, der indeholder 53,8 mikroliter reaktionsbuffer, fem mikroliter enzymopløsning og 1,2 mikroliter af teststoffet, der har inkuberet i 30 minutter.Den anden reaktion blandes to gange som påvist. Og straks overføre 588 mikroliter af opløsning fra jump-fortynding DMSO kontrolrør til et rør, der indeholder 12 mikroliter af substrat med blanding. Fortsætte overførslen af 588 mikroliter fra det hoppefortyndingsprøveblandingsrør, det ufortyndede DMSO-kontrolrør og det ufortyndede reagensstofrør til hvert af de tre 1,5 milliliterrør, der indeholder 12 mikroliter substrat pr. rør, og derefter blandes med 30 sekunders mellemrum.Vent derefter 30 minutter før slukke reaktionerne, indsamle NMR spektre, og beregning af procent hæmning for hvert stof som netop påvist. Her resultaterne for test af to forbindelser mod AgNH i en indledende test sammensat analyse ved hjælp af proton NMR som påvist er vist. Enzymreaktionen observeres lettest og kvantificeres ved, at adenosinsinglen og doublet-resonanserne forsvinder med henholdsvis 8,48 og 6,09 dele pr. million.Og fremkomsten af en adenin singlet bopæl på 8,33 dele per million som observeret i 30-minutters kontrol spektrum. I dette tal vises resultaterne for test af en forbindelse i to koncentrationer mod AgNH i en kontraskærmsanalyse af vaskemiddel ved hjælp af proton NMR som påvist. Der observeres kun minimale forskelle i intensiteten af substratet og produktsignalerne ved hjælp af de to betingelser, hvilket indikerer, at den observerede enzymhæmning ikke er en artefakt af sammensat sammenlægning.Bemærk, at resonanser fra den testede forbindelse og vaskemidlet ikke forstyrrer underlaget eller produktets resonanser. Resultaterne for test af en forbindelse i en jump-fortyndingsanalyse mod AGNH ved hjælp af proton NMR som påvist afslører en reduceret intensitet af substratesignalet i 20-mikromolarreaktionen sammenlignet med 200-mikromolarreaktionen, hvilket indikerer, at hæmningen er reversibel. En komplet prøveblanding under påbegyndelsen af hver reaktion og for jumpfortyndingerne er kritisk.En omhyggelig og konsekvent aspiration og udlevering er påkrævet. NMR-baserede analyser kan også anvendes til at måle enzymaktiviteten i hele celler ved hjælp af en opløsning, der indeholder suspenderede celler i stedet for reaktionsbufferen og enzymet. Vores anti-trichomonal drug discovery indsats fortsætter med at stole på disse analyser til at måle styrken af nyligt syntetiserede forbindelser mod ribohydrolase enzymer.Selv om det kun anvendes i meget små mængder, er den saltsyre, der anvendes til at slukke reaktionerne, farlig og bør anvendes sammen med det korrekte personlige værnemidler.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsætningen Kinetic måling for DNA glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestemmelse af isbindende fly af frostvæskeproteiner ved fluorescens-baserede Ice Plane Affinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleosidtriphosphater - Fra Syntese til Biokemisk karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescens-baserede Overvågning af PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Et kolorimetrisk assay, der specifikt måler Granzyme B proteolytisk aktivitet: Hydrolyse af Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser til Løs Samspil mellem sirtuins (SIRT2) og specifikt protein-substrater

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, Kvantificering og Compound-specifikke isotopanalyse pyrogenfrihed Carbon Brug Benzen polycarboxylsyrer (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-baserede analysen til overvågning Ekstracellulær Nukleotid / nukleosid Metabolisme i Human kronisk lymfatisk leukæmi celler

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

palladium<em&gt; N</em&gt; -Heterocycliske carbenkomplekser: Syntese fra benzimidazoliumsalte og katalytisk aktivitet i carbon-carbon-bindingsdannende reaktioner

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Samtidig måling af HDAC1 og HDAC6 aktivitet i HeLa celler ved hjælp af UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...