Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Nous remercions le Dr Dean Brown d'avoir fourni des composés de la bibliothèque de fragments d'AstraZeneca et le Dr David Parkin d'avoir fourni les enzymes AGNH et UNH. La recherche publiée dans cette publication a été appuyée par le National Institute of Allergy and Infectious Diseases des National Institutes of Health sous le numéro de prix R15AI128585 à B. J. S. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health.Research a également été soutenu par une bourse de recherche d'été Horace G. McDonell décernée à S. N. M., une famille Landesberg Bourse décernée à J. A. G., subventions de perfectionnement du corps professoral et prix de recherche Frederick Bettelheim de l'Université Adelphi à B. J. S.

1. Essais de composés d'essai initiaux à 500 M et 250 M
<ol><li>Préparer le substrat et le composé d'essai pour les réactions.<ol>
<li>Préparer des solutions de stock de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) dans l'eau et 50 mM composé d'essai dans le sulfoxide de diméthyle dilué (DMSO). Consultez la section d'introduction pour les concentrations de solution de substrat à utiliser.</li>
		<li>Ajouter 12 l de substrat (adénosine ou 5-fluorouridine) à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 ml, 1 à 4....

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Les protocoles décrits s'appliquent généralement à de nombreuses enzymes, à condition que les substrats et/ou les produits aient des signaux résolvables dans le spectre de la RMN. Cependant, il est essentiel que la concentration de substrat soit proche de sa valeur Km et suffisamment élevée pour être détectée dans une expérience de RMN dans un délai raisonnable. Une concentration de substrat ne s'est pas supérieure à 2-3x la valeur de Km est optimale pour détecter l...

La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) est bien établie pour caractériser et surveiller les réactions enzymatiques1,2. Les différences dans les changements chimiques et les modèles d'accouplement sont utilisées pour distinguer les résonances du substrat et du produit, et des intensités de résonance relative sont utilisées pour quantifier le pourcentage de la réaction. La consommation de substrat et la création de produits sont directement observées dans le spectre de la RMN. Cela contraste avec la spectrophotométrie ou la spectroscopie fluorescence, dans laquelle le cours du temps de réaction est indiqué par un changement d'absorption attribuable à certaines espèces chimiques consommées ou créées. Tout comme avec les autres méthodes, la RMN peut être utilisée pour étudier les réactions enzymatiques en fonction de la température, du pH ou d'autres conditions de solution, et les effets des inhibiteurs peuvent être déterminés.
Plus récemment, des tests d'activité enzymatiques à base de RMN ont été démontrés pour le dépistage des fragments3,4. Les essais basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai (souvent aussi élevés que 1 mM) nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans l'expérience rmnpeut peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela se compare favorablement aux essais spectrophotométriques où les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet avantage les rend utiles comme essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage de banc5.
Dans notre laboratoire de recherche, des essais d'activité basés sur la RMN sont utilisés pour identifier et évaluer les inhibiteurs des ribohydrolases nucléoside de Trichomonas vaginalis. Le parasite T. vaginalis cause la maladie sexuellement transmissible non virale la plus répandue6. L'augmentation de la résistance aux thérapies existantes7 est à l'origine de la nécessité de nouveaux traitements basés sur des mécanismes, avec des enzymes essentielles de voie de récupération nucléoside représentant des cibles de premier plan8. Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour les enzymes spécifiques à la pyrimidine et à la purine, la ribohydrolase nucléoside d'uridine (UNH)9, et l'adénosine/guanosine préférant la ribohydrolase nucléoside (AGNH)10. Les réactions catalysées par ces deux enzymes sont montrées dans la figure 1. Les essais de RMN sont utilisés pour dépister les bibliothèques de fragments à la recherche de points de départ chimiques, déterminer les valeurs de l'IC50 et éliminer les inhibiteurs de liaison à base d'agrégation ou covalents11. Les mêmes essais sont également traduits pour évaluer l'activité enzymatique dans les cellules entières12.
Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme dans laquelle les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Trois hypothèses ont été faites pour la simplicité. Tout d'abord, le substrat n'est pas spécifié. Pour que les essais d'activité basés sur la RMN soient utiles, la concentration finale du substrat ne devrait pas dépasser 2-3x la valeur Km 4. Dans les exemples montrés, les concentrations finales d'adénosine et defluorouridine 5 sont de 100 M (Km 54 'M) et de 50 'M (Km '15 'M), respectivement. Dans les protocoles, la réalisation de ces concentrations correspond à 12 l de 5 mM d'adénosine ou 12 à L de 2,5 mM 5-fluorouridine.
Deuxièmement, la quantité d'enzyme prévue dans les protocoles, 5 L, a été choisie pour correspondre à la quantité requise pour entraîner une conversion d'environ 75 % du substrat en produit en 30 min. Cette quantité représente généralement une dilution importante à partir d'un stock d'enzymes purifiées, et la dilution doit être déterminée à l'avance pour chaque enzyme. Les solutions de stock d'enzymes AGNH et UNH purifiées sont stockées à -80 oC dans des aliquots qui fournissent suffisamment d'enzymes pour plusieurs milliers de réactions. Ainsi, le facteur de dilution ne doit idéalement être déterminé ou validé que tous les quelques mois. Troisièmement, l'expérience spécifique 1D NMR n'est pas spécifiée. Dans les résultats représentatifs, 1H NMR est montré pour AGNH10 et 19F NMR est montré pour UNH9, avec l'expérience RmN décrite dans les références correspondantes. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible. Enfin, il convient de souligner que l'approche expérimentale décrite ne respecte pas les exigences strictes de la RMN quantitative (RMQ)13,14. Dans le protocole, une réaction en pourcentage est déterminée en utilisant les changements relatifs de l'intensité de la même résonance dans chaque spectre, plutôt qu'en déterminant les concentrations absolues. Cette approche élimine le besoin de modifications à l'acquisition et au traitement des données ainsi que des normes internes ou externes, qui sont requises pour le MRQ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

La spectroscopie RMN est souvent utilisée pour l'identification et la caractérisation des inhibiteurs des enzymes dans la découverte de médicaments, en particulier dans le contexte du dépistage des fragments. Les essais d'activité basés sur la RMN sont idéalement adaptés pour travailler aux concentrations plus élevées de composés d'essai nécessaires pour détecter ces inhibiteurs plus faibles. La plage dynamique et la dispersion des décalages chimiques dans une expérience rmN peuvent facilement résoudre les résonances du substrat, du produit et des composés d'essai. Cela contraste avec les essais spectrophotométriques, dans lesquels les problèmes d'interférence de lecture proviennent souvent de composés avec des profils d'absorption UV-vis qui se chevauchent. En outre, puisqu'ils manquent d'enzymes de journaliste, les essais de RMN à enzyme unique ne sont pas enclins à coupler-assay faux positifs. Cet attribut les rend utiles en tant qu'essais orthogonaux, complétant les essais traditionnels de dépistage à haut débit et les essais de triage sur le banc. Des protocoles détaillés sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli. Les méthodes sont démontrées à l'aide de deux enzymes de ribohydrolase nucléoside. L'utilisation de 1H NMR est montrée pour l'enzyme purine-spécifique, alors que 19NMR de F est montrée pour l'enzyme pyrimidine-spécifique. Les protocoles sont généralement applicables à toute enzyme où les résonances de substrat et de produit peuvent être observées et distinguées par la spectroscopie de RMN. Pour être le plus utile dans le contexte de la découverte de médicaments, la concentration finale de substrat ne doit pas être plus de 2-3x sa valeur Km. Le choix de l'expérience RMN dépend de la réaction enzymatique et des substrats disponibles ainsi que de l'instrumentation RMN disponible.

La figure 2 montre les résultats de l'essai de deux composés contre AGNH à l'aide de 1RmNH H suivant la section 1. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d'adénosine à 8,48 ppm et 6,09 ppm, respectivement, et l'apparition d'une résonance de singlet adénine à 8,33 ppm comme observé dans le contrôle de 30 min spectre. En présence d'un composé 1 de 500 M, aucun produit n'est formé ...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Tests d'activité basés sur la RMN pour déterminer l'inhibition des composés, les valeurs IC50, l'activité artifactual et l'activité à cellules entières des ribohydrolases nucléoside

Des essais d'activité basés sur la RMN ont été développés pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes nucléoside de ribohydrolase. Des protocoles sont fournis pour les essais composés initiaux à 500 m et 250 M, des tests dose-réponse pour déterminer les valeurs IC50, des essais de contre-écran de détergent, des essais de contre-écran de dilution de saut, et des essais dans les cellules entières d'E. coli.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Les analyses d’activité basées sur la NMR fournissent une méthode efficace pour identifier, évaluer et valider les inhibiteurs d’une enzyme donnée. Ils sont particulièrement bien adaptés pour le criblage des fragments. Les analyses NMR sont disponibles aux concentrations composées plus élevées requises pour les inhibiteurs plus faibles.En outre, le manque d’enzymes reporter les rend moins sujettes aux faux positifs. Nous utilisons les analyses NMR dans notre laboratoire pour identifier et caractériser les inhibiteurs de deux enzymes de Trichomonas vaginalis. Les deux enzymes représentent de nouvelles cibles pour de nouveaux médicaments anti-trichomonaux.Les analyses NMR sont généralement applicables à tout domaine de recherche qui implique des enzymes, et ils peuvent même être utilisés pour étudier les enzymes à l’intérieur des cellules. Les aspects les plus importants de la technique sont de s’assurer que les volumes corrects de réaccente sont pipetted et les composants de réaction sont complètement mélangés. Pour préparer le substrat et les composés d’essai, ajouter 12 microlitres de substrat à chacun des quatre tubes de microfuge de 1,5 millilitre et ajouter six microlitres de DMSO déréflé aux tubes de commande à zéro minute et de contrôle de 30 minutes.Ajouter six microlitres du composé d’essai au premier tube expérimental et trois microlitres du composé d’essai et trois microlitres de DMSO stérilisé au deuxième tube expérimental. Ensuite, ajoutez 300 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube de 15 millilitres contenant 2,59 millilitres de tampon de réaction, suivi de 25 microlitres de solution enzymatique. Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction et ajoutez 10 microlitres de 1,5 acide chlorhydrique molaire à un tube de 1,5 millilitre contenant 582 microlitres de solution de stock de réaction.Ensuite, transférez tout le volume de la solution de stock de réaction et de l’acide au tube de commande de zéro minute pour initier et étancher simultanément la réaction de commande de zéro minute. Aspirer et distribuer l’échantillon deux fois d’une manière lente mais délibérée. Initier et exécuter les trois réactions restantes de façon décalée, transférant immédiatement 582 microlitres de la solution de stock de réaction au premier tube expérimental et mélangeant l’échantillon deux fois comme il vient de le démontrer.Une aspiration et une distribution minutieuses assurent un mélange complet pendant les étapes d’initiation. Soyez cohérent avec chaque échantillon pour vous assurer que le mélange différentiel n’est pas une variable. Après 30 secondes, transférer 582 microlitres de solution de stock de réaction au deuxième tube expérimental et mélanger, suivi de l’ajout de 582 autres microlitres de solution de stock de réaction au tube de commande de 30 minutes 30 secondes après le début de la réaction dans le deuxième tube expérimental.Après 30 minutes, ajouter 10 microlitres d’acide chlorhydrique 1,5 molaire au premier tube expérimental, en répétant l’assaisissement à intervalles de 30 secondes pour les deuxièmes tubes de commande expérimentaux et de 30 minutes. Lorsque toutes les réactions ont été éteintes, transférer 600 microlitres de solution de chaque réaction aux tubes NMR. Calculer le pourcentage de conversion du substrat pour les spectres témoins, charger les échantillons sur le spectromètre, recueillir les spectres NMR et superposer les spectres pour les commandes de zéro et de 30 minutes.Mettre à l’échelle le signal du substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au contrôle de 30 minutes et noter ce pourcentage. Ensuite, calculez la conversion en pourcentage comme 100 moins le pourcentage de l’appariement des signaux de substrat. Pour calculer la conversion en pourcentage du substrat pour les réactions contenant le composé d’essai, superposez les spectres pour le contrôle de zéro minute et la première réaction contenant le composé d’essai de 500 micromolaires et échellez le signal de substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au spectre avec le composé d’essai.Notez ce pourcentage et utilisez-le pour calculer la conversion en pourcentage comme nous venons de le démontrer. Ensuite, superposez les spectres pour le contrôle de zéro minute et la première réaction contenant le composé d’essai de 250 micromolaires, et échellez le signal du substrat dans le contrôle de zéro minute pour correspondre au spectre avec le composé d’essai. Après avoir noté le pourcentage, utilisez-le pour calculer la conversion en pourcentage.Pour calculer la réaction en pourcentage et l’inhibition en pourcentage pour chaque concentration composée d’essai, tout d’abord, calculer la réaction en pourcentage comme la conversion en pourcentage du composé d’essai, divisé par la conversion en pourcentage des temps de contrôle 100. Calculez ensuite l’inhibition en pourcentage comme 100 moins la réaction en pourcentage. Pour effectuer un essai de contre-écran détergent, ajoutez 300 microlitres d’oxyde de deutérium et 25 microlitres de solution enzymatique à un tube de 15 millilitres contenant 2,59 millilitres de tampon de réaction.Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction et ajoutez deux microlitres de détergent Triton X-100 à 20 millilitres de tampon de réaction. Ajoutez ensuite 2,59 millilitres de tampon de réaction, contenant 0,01 % de détergent Triton X-100 à un nouveau tube conique de 15 millilitres. Ajouter ensuite 300 microlitres d’oxyde de deutérium et 25 microlitres de solution enzymatique au tube.Inversez doucement le tube deux fois pour mélanger la solution de stock de réaction. Ensuite, déterminez l’inhibition pour cent pour les composés d’essai de 100 micromolaires et de 50 micromolaires comme juste démontré. Utilisation de la solution de stock de réaction sans détergent, pour un ensemble de quatre tubes et la solution de stock de réaction avec détergent pour un deuxième ensemble de quatre tubes.Pour effectuer une dilution de saut, transférez 468 microlitres de tampon de réaction et 60 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube contenant 53,8 microlitres de tampon de réaction, cinq microlitres de solution enzymatique et 1,2 microlitres de DMSO qui incuberaient depuis 30 minutes. Aspirer et distribuer le mélange deux fois d’une manière lente, mais délibérée. Avant de transférer 468 microlitres de tampon de réaction et 60 microlitres d’oxyde de deutérium à un tube contenant 53,8 microlitres de tampon de réaction, cinq microlitres de solution enzymatique, et 1,2 microlitres de composé d’essai qui a été incuber pendant 30 minutes.Mélanger la deuxième réaction deux fois comme démontré. Et transférez immédiatement 588 microlitres de solution du tube de commande DMSO jump-dilution à un tube contenant 12 microlitres de substrat avec mélange. Continuez à transférer 588 microlitres du tube composé d’essai de saut-dilution, du tube de commande non dilué de DMSO, et du tube composé d’essai non dilué à chacun des trois tubes de 1,5 millilitre, contenant 12 microlitres de substrat par tube avec mélange à intervalles de 30 secondes par la suite.Ensuite, attendez 30 minutes avant d’étancher les réactions, la collecte des spectres NMR, et le calcul de l’inhibition pour cent pour chaque composé comme vient de le démontrer. Ici, les résultats pour tester deux composés contre AgNH dans un essai composé d’essai initial utilisant proton NMR comme démontré sont montrés. La réaction enzymatique est plus facilement observée et quantifiée par la disparition des résonances de singlet et de doublet d’adénosine à 8,48 et 6,09 parties par million respectivement.Et l’apparition d’une résidence singlet adénoine à 8,33 parties par million comme on l’observe dans le spectre de contrôle de 30 minutes. Dans ce chiffre, les résultats pour tester un composé à deux concentrations contre AgNH dans un essai de contre-écran de détergent utilisant le proton NMR comme démontré sont montrés. Seules des différences minimales sont observées dans les intensités du substrat et les signaux du produit en utilisant les deux conditions, ce qui indique que l’inhibition enzymatique observée n’est pas un artefact de l’agrégation composée.Notez que les résonances résultant du composé testé et du détergent n’interfèrent pas avec le substrat ou les résonances du produit. Les résultats pour l’essai d’un composé dans un essai de saut-dilution contre AGNH utilisant le proton NMR comme démontré indiquent une intensité réduite du signal de substrat dans la réaction de 20 micromolaires comparée à la réaction de 200 micromolaires, indiquant que l’inhibition est réversible. Un mélange complet de l’échantillon pendant l’initiation de chaque réaction et pour les dilutions de saut est critique.Une aspiration et une dispense prudentes et cohérentes sont nécessaires. Les analyses à base de NMR peuvent également être utilisées pour mesurer l’activité enzymatique dans des cellules entières, à l’aide d’une solution contenant des cellules en suspension à la place du tampon de réaction et de l’enzyme. Nos efforts de découverte de médicaments anti-trichomonaux continuent de s’appuyer sur ces analyses pour mesurer la puissance des composés nouvellement synthétisés contre les enzymes ribohydrolase.Même s’il n’est utilisé qu’en très petites quantités, l’acide chlorhydrique utilisé pour étancher les réactions est dangereux et doit être utilisé avec l’équipement de protection individuelle approprié.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Recherche

Chimie

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Un dosage colorimétrique qui mesure spécifiquement l&#39;activité protéolytique Granzyme B: hydrolyse de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Désacétylation essais pour démêler les Interplay entre sirtuines (SIRT2) et protéines substrats spécifiques

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Caractérisation, Quantification et spécifiques composé isotopiques Analyse des pyrogénée carbone Utilisation Benzène Acides polycarboxyliques (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium<em&gt; N</em&gt; - Complexes de carbène hétérocyclique: synthèse des sels de benzimidazolium et activité catalytique dans les réactions de formation de liaison carbone-carbone

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Mesure simultanée de HDAC1 et de HDAC6 activité en HeLa cellules utilisant UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...