Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Wir danken Dr. Dean Brown für die Bereitstellung von Verbindungen aus der AstraZeneca-Fragmentbibliothek und Dr. David Parkin für die Bereitstellung der Enzyme AGNH und UNH. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of Allergy and Infectious Diseases der National Institutes of Health unter der Award-Nummer R15AI128585 an B. J. S. unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar. Research wurde auch von einem Horace G. McDonell Summer Research Fellowship unterstützt, das S. N. M., einer Landesberg-Familie, verliehen wurde. Stipendium an J. A. G. und Fakultätsentwicklungsstipendien und Frederick Bettelheim Research Award von der Adelphi University an B. J. S.

1. Erste Test-Compound-Assays bei 500 m und 250 m
<ol><li>Substrat und Testverbindung auf Reaktionen vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie Lagerlösungen von Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) in Wasser und 50 mM Testverbindung in deuteriertem Dimethylsulfoxid (DMSO) vor. Siehe Einführungsabschnitt für Konzentrationen von Substratlösung zu verwenden.</li>
		<li>Fügen Sie jeweils 12 l Substrat (Adenosin oder 5-Fluorouridin) zu je vier 1,5 ml Mikrofuge-Röhren, 1–4 hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie den Röhren 1 (0 min...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Die beschriebenen Protokolle sind allgemein auf viele Enzyme anwendbar, sofern die Substrate und/oder Produkte lösbare Signale im NMR-Spektrum aufweisen. Es ist jedoch entscheidend, dass die Konzentration des Substrats nahe an seinem Km-Wert liegt und hoch genug ist, um in einem NMR-Experiment innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens nachgewiesen zu werden. Eine Substratkonzentration von nicht mehr als dem 2-3x k m-Wert ist optimal für die Erkennung von wettbewerbsorientierten, nicht wettbe...

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) ist für die Charakterisierung und Überwachung von Enzymreaktionen1,2etabliert. Unterschiede in chemischen Verschiebungen und Kopplungsmustern werden verwendet, um Substrat- und Produktresonanzen zu unterscheiden, und relative Resonanzintensitäten werden verwendet, um den Prozentsatz der Reaktion zu quantifizieren. Sowohl der Verbrauch von Substrat als auch die Produktherstellung werden direkt im NMR-Spektrum beobachtet. Dies steht im Gegensatz zur Spektrophotometrie oder Fluoreszenzspektroskopie, bei der der Reaktionszeitverlauf durch eine Änderung der Absorption angezeigt wird, die darauf zurückzuführen ist, dass einige chemische Arten konsumiert oder erzeugt werden. Wie bei den anderen Methoden kann NMR verwendet werden, um Enzymreaktionen in Abhängigkeit von Temperatur, pH oder anderen Lösungsbedingungen zu untersuchen, und die Wirkung von Inhibitoren kann bestimmt werden.
In jüngerer Zeit wurden NMR-basierte Enzymaktivitätstests für das Fragmentscreening3,4gezeigt. NMR-basierte Assays eignen sich ideal für die Arbeit an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen (oft bis zu 1 mM), die zum Nachweis dieser schwächeren Inhibitoren erforderlich sind. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion im NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies ist im Vergleich zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme häufig durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieser Vorteil macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Hochdurchsatz-Screening-Assays und Tischtriage-Assays5ergänzen.
In unserem Forschungslabor werden NMR-basierte Aktivitätstests verwendet, um Inhibitoren von Trichomonas vaginalis Nukleosidribohydrolasen zu identifizieren und zu bewerten. Der T. vaginalis Parasit verursacht die am weitesten verbreitete nicht-virale sexuell übertragbare Krankheit6. Die zunehmende Resistenz gegen bestehende Therapien7 treibt die Notwendigkeit neuartiger, mechanismusbasierter Behandlungen mit essentiellen Nukleosid-Rettungswegenzymen voran, die Primziele8darstellen. NMR-basierte Aktivitätsassays wurden sowohl für Pyrimidin- als auch für Purin-spezifische Enzyme, Uridinnukleosidribohydrolase (UNH)9und Adenosin/Guanosin entwickelt, die Nukleosidribohydrolase (AGNH)10bevorzugen. Die reaktionen, die durch diese beiden Enzyme katalysiert werden, sind in Abbildung 1dargestellt. Die NMR-Assays werden verwendet, um Fragmentbibliotheken auf chemische Ausgangspunkte zu untersuchen,IC-50-Werte zu bestimmen und aggregationsbasierte oder kovalente Bindungsinhibitoren auszusondern11. Die gleichen Assays werden auch übersetzt, um die Enzymaktivität in ganzen Zellen zu bewerten12.
Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, in dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Aus Gründen der Einfachheit wurden drei Annahmen getroffen. Erstens ist das Substrat nicht angegeben. Damit NMR-basierte Aktivitätstests nützlich sind, sollte die Endkonzentration des Substrats nicht mehr als das 2-3x des K m-Wertes4betragen. In den gezeigten Beispielen liegen die Endkonzentrationen von Adenosin und 5-Fluorouridin bei 100 m (Km = 54 m) bzw. 50 m (Km = 15 m). In den Protokollen entspricht die Erreichung dieser Konzentrationen 12 l 5 mM Adenosin oder 12 l mit 2,5 mM 5-Fluorouridin.
Zweitens wurde die in den Protokollen vorgesehene Enzymmenge 5 l so gewählt, dass sie der Menge entspricht, die erforderlich ist, um eine Umwandlung des Substrats in ein Produkt in 30 min zu erreichen. Diese Menge stellt in der Regel eine große Verdünnung aus einem gereinigten Enzymbestand dar, und die Verdünnung muss im Voraus für jedes Enzym bestimmt werden. Gereinigte AGNH- und UNH-Enzym-Lagerlösungen werden bei -80 °C in Aliquots gespeichert, die genügend Enzym für mehrere tausend Reaktionen liefern. Daher muss der Verdünnungsfaktor idealerweise nur alle paar Monate ermittelt oder validiert werden. Drittens ist das spezifische 1D-NMR-Experiment nicht angegeben. In den repräsentativen Ergebnissen wird 1H NMR für AGNH10 und 19F NMR für UNH9gezeigt, wobei das NMR-Experiment in den entsprechenden Referenzen beschrieben wird. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab. Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass der beschriebene versuchsweise Ansatz nicht den strengen Anforderungen der quantitativen NMR (qNMR)13,14entspricht. Im Protokoll wird eine prozentuale Reaktion anhand der relativen Intensitätsänderungen der gleichen Resonanz in jedem Spektrum bestimmt, anstatt durch die Bestimmung absoluter Konzentrationen. Dieser Ansatz eliminiert die Notwendigkeit von Änderungen an der Datenerfassung und -verarbeitung sowie für interne oder externe Standards, die für qNMR erforderlich sind.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

Die NMR-Spektroskopie wird häufig zur Identifizierung und Charakterisierung von Enzyminhibitoren bei der Arzneimittelentdeckung eingesetzt, insbesondere im Rahmen des Fragmentscreenings. NMR-basierte Aktivitätstests sind ideal geeignet, um an den höheren Konzentrationen von Testverbindungen zu arbeiten, die erforderlich sind, um diese schwächeren Inhibitoren zu erkennen. Der Dynamikbereich und die chemische Verschiebungsdispersion in einem NMR-Experiment können Resonanzen von Substrat-, Produkt- und Prüfverbindungen problemlos auflösen. Dies steht im Gegensatz zu spektrophotometrischen Assays, bei denen ausgelesene Interferenzprobleme oft durch Verbindungen mit überlappenden UV-Vis-Absorptionsprofilen entstehen. Da ihnen außerdem Reporterenzyme fehlen, sind die Single-Enzym-NMR-Assays nicht anfällig für gekoppelte Fehlalarme. Dieses Attribut macht sie nützlich als orthogonale Assays, die traditionelle Screening-Assays mit hohem Durchsatz und Banktop-Triage-Assays ergänzen. Detaillierte Protokolle sind für anfängliche zusammengesetzte Assays bei 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen vorgesehen. Die Methoden werden mit zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen demonstriert. Die Verwendung von 1H NMR wird für das purinspezifische Enzym gezeigt, während 19F NMR für das Pyrimidin-spezifische Enzym gezeigt wird. Die Protokolle sind allgemein auf jedes Enzym anwendbar, bei dem Substrat- und Produktresonanzen beobachtet und durch NMR-Spektroskopie unterschieden werden können. Um im Zusammenhang mit der Entdeckung von Arzneimitteln am nützlichsten zu sein, sollte die endgültige Konzentration von Substrat nicht mehr als das 2-3-fache seines K-m-Wertes betragen. Die Wahl des NMR-Experiments hängt von der enzymischen Reaktion und den verfügbaren Substraten sowie der verfügbaren NMR-Instrumentierung ab.

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse für die Prüfung von zwei Verbindungen mit AGNH unter Verwendung von 1H NMR nach Abschnitt 1. Die Enzymreaktion wird am leichtesten beobachtet und quantifiziert durch das Verschwinden von Adenosin-Singlet- und Doublet-Resonanzen bei 8,48 ppm bzw. 6,09 ppm und das Auftreten einer Adenin-Singlet-Resonanz bei 8,33 ppm, wie bei der 30 min-Kontrolle beobachtet spektrum. In Gegenwart von 500 m Verbindung 1 wird kein Produkt gebildet, wie das Fehlen eine...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-basierte Aktivitätsassays wurden entwickelt, um Inhibitoren von zwei Nukleosid-Ribohydrolase-Enzymen zu identifizieren und zu charakterisieren. Es werden Protokolle für anfängliche zusammengesetzte Assays mit 500 m und 250 M, Dosis-Wirkungs-Assays zur Bestimmung der IC-50-Werte, Waschmittel-Gegensieb-Assays, Jump-Dilution-Zähler-Screen-Assays und Assays in E. coli-Vollzellen bereitgestellt.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR-basierte Aktivitätstests bieten eine effektive Methode zur Identifizierung, Bewertung und Validierung von Inhibitoren für ein bestimmtes Enzym. Sie eignen sich besonders gut für das Fragmentscreening. NMR-Assays sind für die höheren Zusammengesetzten Konzentrationen geeignet, die für schwächere Inhibitoren erforderlich sind.Darüber hinaus macht der Mangel an Reporterenzymen sie weniger anfällig für falsche Positive. Wir verwenden die NMR-Assays in unserem Labor, um die Inhibitoren von zwei Enzymen aus Trichomonas vaginalis zu identifizieren und zu charakterisieren. Beide Enzyme stellen neue Ziele für neuartige Anti-Trichomonal-Medikamente dar.Die NMR-Assays sind allgemein auf jeden Forschungsbereich anwendbar, der Enzyme umfasst, und sie können sogar verwendet werden, um die Enzyme in Zellen zu untersuchen. Die wichtigsten Aspekte der Technik sind, sicherzustellen, dass die richtigen Reagenzvolumina pipetiert und die Reaktionskomponenten gründlich gemischt werden. Zur Vorbereitung des Substrats und der Prüfverbindungen fügen Sie jeweils 12 Mikroliter Substrat zu vier 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Rohren hinzu und fügen sechs Mikroliter deuterated DMSO in die Null-Minuten-Steuerung und 30-Minuten-Steuerröhrchen.Fügen Sie dem ersten Versuchsröhrchen sechs Mikroliter der Testverbindung und dem zweiten Versuchsröhrchen drei Mikroliter der Testverbindung und drei Mikroliter deuterated DMSO hinzu. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid in eine 15-Milliliter-Röhre mit 2,59 Milliliter Reaktionspuffer, gefolgt von 25 Mikroliter Enzymlösung. Um die Reaktionsstofflösung vorsichtig zweimal umzukehren und 10 Mikroliter 1,5 Molsalzsäure in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 582 Mikroliter Reaktionsstofflösung zu geben.Übertragen Sie dann das gesamte Volumen der Reaktionsstofflösung und Säure in das Null-Minuten-Steuerrohr, um gleichzeitig die Null-Minuten-Kontrollreaktion zu initiieren und zu löschen. Die Probe zweimal langsam, aber absichtlich anzuzapfen und zu dosieren. Initiieren und führen Sie die restlichen drei Reaktionen gestaffelt aus, indem Sie sofort 582 Mikroliter der Reaktionsstocklösung auf das erste Versuchsrohr übertragen und die Probe wie soeben gezeigt zwei Mal mischen.Eine sorgfältige Aspiration und Dosierung sorgt für eine vollständige Vermischung während der Initiationsschritte. Seien Sie mit jeder Probe konsistent, um sicherzustellen, dass die Differenzmischung keine Variable ist. Übertragen Sie nach 30 Sekunden 582 Mikroliter Reaktionsstocklösung in die zweite Versuchsröhre und -mischung, gefolgt von der Zugabe weiterer 582 Mikroliter Reaktionsstocklösung in das 30-Minuten-Steuerrohr 30 Sekunden nach Beginn der Reaktion im zweiten Versuchsrohr.Nach 30 Minuten 10 Mikroliter 1,5-Mol-Salzsäure in das erste Versuchsrohr geben und die Abschreckung in 30-Sekunden-Intervallen für die zweite Versuchs- und 30-Minuten-Kontrollröhre wiederholen. Wenn alle Reaktionen abgeschreckt sind, übertragen Sie 600 Mikroliter Lösung aus jeder Reaktion auf NMR-Röhren. Um die prozentuale Umwandlung des Substrats für die Kontrollspektren zu berechnen, laden Sie die Proben auf das Spektrometer, sammeln Sie die NMR-Spektren und überlagern Sie die Spektren für die Null- und 30-Minuten-Steuerung.Skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um dem 30-Minuten-Steuerelement zu entsprechen, und notieren Sie diesen Prozentsatz. Berechnen Sie dann die prozentuale Umwandlung als 100 minus den Prozentsatz aus dem Abgleich der Substratsignale. Um die prozentuale Umwandlung des Substrats für die Reaktionen zu berechnen, die die Testverbindung enthalten, überlagern Sie die Spektren für die Null-Minuten-Steuerung und die erste Reaktion, die die 500-Mikromolar-Testverbindung enthält, und skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um das Spektrum mit der Testverbindung abzugleichen.Notieren Sie sich diesen Prozentsatz, und verwenden Sie ihn, um die prozentuale Umrechnung zu berechnen, wie gerade gezeigt. Überlagern Sie dann die Spektren für die Null-Minuten-Steuerung und die erste Reaktion, die die 250-Mikromolar-Testverbindung enthält, und skalieren Sie das Substratsignal in der Null-Minuten-Steuerung, um das Spektrum mit der Testverbindung abzugleichen. Nachdem Sie den Prozentsatz notiert haben, verwenden Sie ihn, um die Prozentuale Konvertierung zu berechnen.Um die prozentuale Reaktion und die prozentuale Hemmung für jede Testverbindungskonzentration zu berechnen, berechnen Sie zunächst die prozentuale Reaktion als prozentuale Umwandlung der Testverbindung, dividiert durch die prozentuale Umwandlung der Regelzeiten 100. Berechnen Sie dann die prozentuale Hemmung als 100 minus die prozentuale Reaktion. Um einen Waschmittelzähler-Bildschirmtest durchzuführen, fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid und 25 Mikroliter Enzymlösung in eine 15-Milliliter-Röhre mit 2,59 Milliliter Reaktionspuffer.Um die Reaktionsstofflösung vorsichtig umzudrehen, um die Reaktionsstocklösung zu mischen, und fügen Sie zwei Mikroliter Triton X-100 Waschmittel zu 20 Milliliter Reaktionspuffer hinzu. Fügen Sie dann 2,59 Milliliter Reaktionspuffer, der 0,01%Triton X-100 Waschmittel enthält, zu einem neuen 15-Milliliter-Konikonrohr hinzu. Dann fügen Sie 300 Mikroliter Deuteriumoxid und 25 Mikroliter Enzymlösung in die Röhre.Um die Röhre zwei Mal sanft umzukehren, um die Reaktionsstocklösung zu mischen. Bestimmen Sie dann die prozentuale Hemmung der 100-Mikromolaren- und 50-Mikromolar-Testverbindungen, wie soeben nachgewiesen. Verwendung der Reaktionsstofflösung ohne Waschmittel, für einen Satz von vier Röhren und die Reaktionsstofflösung mit Waschmittel für einen zweiten Satz von vier Röhren.Um eine Sprungverdünnung durchzuführen, übertragen Sie 468 Mikroliter Reaktionspuffer und 60 Mikroliter Deuteriumoxid in ein Rohr mit 53,8 Mikroliter Reaktionspuffer, fünf Mikroliter Enzymlösung und 1,2 Mikroliter DMSO, das seit 30 Minuten inkubiert wird. Die Mischung zwei Mal langsam, aber absichtlich ansaugen und abgeben. Vor der Übertragung von 468 Mikroliter Reaktionspuffer und 60 Mikroliter Deuteriumoxid in ein Rohr mit 53,8 Mikroliter Reaktionspuffer, fünf Mikroliter Enzymlösung und 1,2 Mikroliter Testverbindung, die seit 30 Minuten inkubiert wird.Mischen Sie die zweite Reaktion zwei Mal, wie gezeigt. Und sofort 588 Mikroliter Lösung aus dem Sprungverdünnungs-DMSO-Steuerrohr auf ein Rohr mit 12 Mikroliter Substrat mit Mischen übertragen. Weiter transferieren 588 Mikroliter aus dem Jump-Dilution-Testverbundrohr, dem unverdünnten DMSO-Steuerrohr und dem unverdünnten Reagenzglas auf jeweils drei 1,5-Milliliter-Röhren, die 12 Mikroliter Substrat pro Tube enthalten und anschließend in 30-Sekunden-Intervallen mischen.Warten Sie dann 30 Minuten, bevor Sie die Reaktionen löschen, die NMR-Spektren sammeln und die prozentuale Hemmung für jede Verbindung berechnen, wie gerade gezeigt. Hier werden die Ergebnisse für die Prüfung von zwei Verbindungen gegen AgNH in einem ersten Test-Compound-Assay mit Proton NMR gezeigt, wie gezeigt. Die Enzymreaktion wird am leichtesten beobachtet und quantifiziert durch das Verschwinden der Adenosin-Singlet- und Doublet-Resonanzen bei 8,48 bzw. 6,09 Teilen pro Million.Und das Auftreten einer adeninen Singlet-Residenz bei 8,33 Teilen pro Million, wie im 30-Minuten-Kontrollspektrum beobachtet. In dieser Abbildung werden die Ergebnisse für die Prüfung einer Verbindung in zwei Konzentrationen gegen AgNH in einem Waschmittel-Gegensieb-Assay mit Proton NMR, wie gezeigt, gezeigt. Nur minimale Unterschiede werden in den Intensitäten des Substrats und der Produktsignale unter Verwendung der beiden Bedingungen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die beobachtete Enzymhemmung kein Artefakt der zusammengesetzten Aggregation ist.Beachten Sie, dass Resonanzen, die aus der getesteten Verbindung und dem Reinigungsmittel entstehen, das Substrat oder die Produktresonanzen nicht stören. Die gezeigten Ergebnisse für die Prüfung einer Verbindung in einem Jump-Dilution-Assay gegen AGNH mit Proton NMR zeigen eine reduzierte Intensität des Substratsignals in der 20-Mikromolaren-Reaktion im Vergleich zur 200-Mikromolaren-Reaktion, was darauf hindeutet, dass die Hemmung reversibel ist. Eine vollständige Probenmischung während der Einleitung jeder Reaktion und für die Sprungverdünnungen ist entscheidend.Eine sorgfältige und konsistente Aspiration und Abgabe ist erforderlich. NMR-basierte Assays können auch verwendet werden, um die Enzymaktivität in ganzen Zellen zu messen, mit einer Lösung, die suspendierte Zellen anstelle des Reaktionspuffers und enzyms enthält. Unsere Anti-Trichomonal-Medikamente-Entdeckungsbemühungen verlassen sich weiterhin auf diese Assays, um die Wirksamkeit neu synthetisierter Verbindungen gegen die Ribohydrolase-Enzyme zu messen.Obwohl es nur in sehr geringen Mengen verwendet wird, ist die Salzsäure, die zum Abschrecken der Reaktionen verwendet wird, gefährlich und sollte mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-State-, Pre-Steady-State-und Einzel-Umsatz Kinetic Measurement für DNA Glycosylase Aktivität

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Forschung

Chemie

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestimmung der eisbindenden Ebenen von Frostschutzproteinen durch Fluoreszenzbasierte Eisebene Affinität

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluoreszenz-basierte Überwachung von PAD4 Aktivität über eine Pro-Fluoreszenz Substratanalogon

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylierung Assays zu entwirren, das Zusammenspiel zwischen Sirtuine (SIRT2) und spezifische Protein-Substrate

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Charakterisierung, Quantifizierung und substanzspezifische Isotopenanalyse von Pyrogene Kohle Benzolpolycarbonsäuren (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-basierten Assay extrazelluläre Nucleotid / Nukleosid Metabolismus in menschlichen chronischer lymphatischer Leukämie-Zellen zu überwachen

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium<em&gt; N.</em&gt; -Heterocyclische Carbenkomplexe: Synthese aus Benzimidazoliumsalzen und katalytische Aktivität bei Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungs-bildenden Reaktionen

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Gleichzeitige Messung von HDAC1 und HDAC6 Tätigkeit in HeLa-Zellen mit UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...