Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

אנו מודים לד ר הדיקן בראון על מתן תרכובות מספריית החלקים של אסטרזמקה וד ר דוד פרקין למתן אנזימים בעלי הדין והאנזים. המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת הפרס מספר R15AI128585 ל B. J. S. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. המחקר נתמך גם על ידי מלגת מחקר הקיץ של הוראס ג'י מק הוענק ל-S. N. M, משפחת לנדסברג המענק הוענק לג א., ולמענקים לפיתוח הפקולטה ולפרס פרדריק בטלהיים מאוניברסיטת אדלפי, לשנת B. J.

1. מתחם הבדיקה הראשונית בחני ב 500 μm ו 250 μm
<ol><li>הכינו מצע ומתחם בדיקה לתגובות.<ol>
<li>הכנת פתרונות המניה של מצע (אדנוזין או 5-פלואורוורידיין) במים ובמתחם 50 mM במבחן diמתיל סולפוקסיד (DMSO). עיין בסעיף המבוא לריכוזים של פתרון מצע לשימוש.</li>
		<li>הוסף 12 μL של מצע (אדנוזין או 5-פלואורולדין) לכל אחד מ-4 1.5 mL micro...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

הפרוטוקולים המתוארים הם חלים בדרך כלל על אנזימים רבים, בתנאי כי מצעים ו/או מוצרים יש אותות הניתנים לפתירה בספקטרום NMR. עם זאת, חשוב כי ריכוז המצע קרוב לערך Km שלה מספיק גבוה כדי להתגלות בניסוי nmr בתוך פרק זמן סביר. המצע ריכוז לא גבוה יותר 2-3x ערך Km הוא אופטימלי לגילוי תחרות...

תהודה מגנטית גרעינית (nmr) ספקטרוסקופיית מבוססת היטב לאפיון וניטור של תגובות אנזימים1,2. הבדלים במשמרות כימיים ודפוסי צימוד משמשים להבחנה בין המצע לבין מוצרים, ועוצמות תהודה יחסיות משמשות לכמת את אחוז התגובה. הן צריכת המצע והן יצירת המוצר מתבוננים ישירות בספקטרום NMR. זה נוגד את הספקטרוסקופיית הספקטרופוטומטר או הפלואורסצנטית, שבו קורס זמן התגובה מצוין על ידי שינוי בספיגה המיוחס למינים כימיים שנצרכים או נוצרו. בדיוק כמו עם שיטות אחרות, NMR יכול לשמש כדי ללמוד תגובות אנזימים כפונקציה של טמפרטורה, pH, או תנאי פתרון אחרים, ואת ההשפעות של מעכבי ניתן לקבוע.
לאחרונה, nmr-מבוססי האנזים פעילות אנזימים הוכחו עבור הקרנת קטע3,4. Nmr מבוסס בחני מתאים באופן אידיאלי לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן (לעתים קרובות גבוה כמו 1 מ"מ) נדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה משווה בחיוב על spectrophotometric בחני היכן בעיות התערבות קריאה-out מתעוררות לעתים קרובות מתרכובות עם פרופילי UV-vis חופפים. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. יתרון זה הופך אותם לשימושיים כגון אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת תפוקה גבוההומיון שחקן ראשי.
במעבדת המחקר שלנו, בחני-מבוסס על הפעילות המבוססת משמשים כדי לזהות ולהעריך מעכבי של trichomonas וגיפרוציץ נוקלאוסייד ריבוליסיס. הטפיל ה -T וגינגיט גורם למחלות המועברות במין הלא-נגיפית הנפוצות ביותר6. התנגדות הגוברת לטיפולים הקיימים7 הוא המניע את הצורך הרומן, מנגנון מבוססי טיפולים, עם מסלול הצלה נוקלאוטיבצד העיקרי המייצג יעדים ראשוניים8. NMR-מבוסס על פעילות שפותחה עבור pyrimidine ו-purine הסגולי, ולאחר הריבוהידקלז נוקלאוטיל9, ו אדנוזין/guanosine העדפת נוקלאוטיההידרוקלז (agnh)10. התגובות מזרז על ידי שני אנזימים אלה מוצגים באיור 1. Nmr בחני נמצאים בשימוש כדי להקרין ספריות קטע עבור נקודות ההתחלה כימיים, לקבוע את IC50 ערכים, ולעשב מתחת מעכבי מבוסס מצבור או מעכבים כריכה מבוססת11. אותו הדבר גם להיות מתורגם כדי להעריך את פעילות האנזים בתאים שלמים12.
פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו ניתן להבחין במצע ומוצרי מוצר ולהבחין בספקטרוסקופיית NMR. . שלוש הנחות נעשו לפשטות ראשית, המצע לא צוין. עבור הפעילות nmr-מבוסס בחני אומר להיות שימושי, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר מ 2-3x הערך Km 4. בדוגמאות המוצגות, הריכוזים הסופיים של אדנוזין ו 5-פלואורוורידין הם 100 μM (km = 54 μm) ו 50 μm (km = 15 μm), בהתאמה. בפרוטוקולים, השגת ריכוזים אלה מתאים 12 μL של 5 מ"מ אדנוזין או 12 μL של 2.5 mM 5-פלואור.
שנית, כמות האנזים המסופק עבור בפרוטוקולים, 5 μL, נבחר להתאים את הסכום הנדרש כדי לגרום כ 75% המרה של מצע למוצר בתוך 30 דקות. כמות זו מייצגת בדרך כלל דילול גדול ממניות אנזימים מטוהרים, והדילול חייב להיקבע מראש לכל אנזים. מטוהרים AGNH ופתרונות מלאי אנזימים מאוחסנים ב-80 ° c ב ali, אשר מספקים מספיק אנזים עבור כמה אלפי תגובות. לפיכך, גורם הדילול באופן אידיאלי צריך להיקבע או להיות מאומת כל כמה חודשים. שלישית, ניסוי 1D NMR הספציפי לא צוין. בתוצאות הנציג, 1H nmr מוצג עבור agnh10 ו- 19F nmr מוצג עבור ללא9, עם ניסוי nmr המתואר ההפניות המתאימות. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין. לבסוף, יש לציין כי הגישה הניסיונית תיאר אינו תואם את הדרישות הקפדניות של nmr כמותי (qnmr)13,14. בפרוטוקול, תגובת אחוז נקבעת באמצעות השינויים היחסיים באינטנסיביות של אותה תהודה בכל קשת, ולא על-ידי קביעת ריכוזים מוחלטים. גישה זו מבטלת את הצורך ברכישת נתונים ועיבוד שינויים, כמו גם סטנדרטים פנימיים או חיצוניים, אשר נדרשים qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

ספקטרוסקופיית NMR משמש לעתים קרובות לזיהוי ואפיון של מעכבי אנזימים בגילוי הסמים, במיוחד בהקשר של הקרנת קטע. NMR-מבוסס על פעילות מבוססת באופן אידיאלי מתאים לעבוד בריכוזים גבוהים יותר של תרכובות מבחן הנדרש כדי לזהות אלה מעכבי חלשים. הטווח הדינמי ופיזור המשמרת הכימית בניסוי NMR יכול בקלות לפתור מהדהד ממצע, מוצר, ותרכובות בדיקה. זה ניגודים עם spectrophotometric assays, שבו לקרוא בעיות התערבות לעתים קרובות נובעים תרכובות עם חופפים UV-vis פרופילים הקליטה. בנוסף, מאז הם חסרי אנזימים עיתונאי, האנזים היחיד nmr בחני אינם נוטים להיות מצמידים משולב חיוביות שווא. תכונה זו הופכת אותם לשימושיים כמו אורתוגונאליות, משלימים את ההקרנה המסורתית של הקרנת התפוקה ואת שחקן הראש. פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב 500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי המונה המסך מונה, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם. השיטות מודגמות באמצעות שני אנזימים ריבוהידרוקלז. השימוש 1H nmr מוצג עבור אנזים ספציפי purine, בעוד 19F nmr מוצג עבור האנזים הספציפי pyrimidine. הפרוטוקולים חלים בדרך כלל על כל אנזים שבו התהודה המצע מוצר ניתן לצפות ומכובד על ידי הספקטרוסקופיית NMR. כדי להיות שימושי ביותר בהקשר של גילוי סמים, הריכוז הסופי של מצע צריך להיות לא יותר 2-3x הערך Km שלה. הבחירה של הניסוי NMR תלוי בתגובת אנזימים ומצעים זמינים, כמו גם מכשור NMR זמין.

איור 2 מציג את התוצאות עבור בדיקת שתי תרכובות נגד agnh באמצעות 1H nmr לאחר סעיף 1. תגובת האנזים הוא נצפתה ביותר בקלות וכימות על ידי העלמות של אדנוזין סינגקל ובלתי מאפשרים מהדהד ב 8.48 ppm ו 6.09 ppm, בהתאמה, ואת המראה של אדנוטין סינגקל תהודה ב 8.33 לדפים לדקה כפי שנצפתה 30 דקות בקרת ספק...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-מבוסס על פעילות מבוססת על קביעת עיכוב מורכבים, IC50 ערכים, פעילות פרועובדתית, ואת הפעילות התא כולו של נוקלאוטילסייד הריבוליטיות

NMR-מבוסס על פעילות שפותחה כדי לזהות ולאפיין מעכבי של שני אנזימים ריבוהיהידרוקלז. הפרוטוקולים מסופקים עבור בחני התרכובת הראשונית ב-500 μm ו 250 μm, מינון התגובה בחני לקביעת ערכי IC50 , ניקוי נוזל מונה המסך, לקפוץ-דילול מונה מסך בחני, ו בחני בתאי E. coli שלם.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

מסיאי פעילות מבוססי NMR מספקים שיטה יעילה לזיהוי, הערכה ואימות מעכבים עבור אנזים נתון. הם מתאימים במיוחד להקרנת קטעים. מסיאי NMR נוחים לריכוזים התרכובת הגבוהים הנדרשים למעכבים חלשים יותר.בנוסף, המחסור באנזימים עיתונאיים הופך אותם לפחות נוטים לחיוביות שגויות. אנו משתמשים בבדיקות NMR במעבדה שלנו כדי לזהות ולאפיין את המעכבים של שני אנזימים מ- Trichomonas vaginalis. שני האנזימים מייצגים מטרות חדשות לתרופות אנטי-טריכומונליות חדשניות.ה- NMR מקשה בדרך כלל על כל תחום מחקר המערב אנזימים, והם יכולים אפילו לשמש לחקר האנזימים בתוך התאים. ההיבטים החשובים ביותר של הטכניקה הם להבטיח כי כרכים ריאגנט הנכון הם pipetted ואת רכיבי התגובה מעורבבים ביסודיות. כדי להכין את המצע ואת תרכובות הבדיקה, להוסיף 12 microliters של מצע לכל אחד מארבעה צינורות microfuge 1.5 מיליליטר ולהוסיף שישה microliters של DMSO deuterated לבקרה אפס דקות צינורות בקרה 30 דקות.הוסף שישה מיקרוליטרים של תרכובת הבדיקה לצינור הניסוי הראשון ושלושה מיקרוליטרים של תרכובת הבדיקה ושלושה מיקרוליטרים של DMSO deuterated לצינור הניסוי השני. לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור 15 מיליליטר המכיל 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה, ואחריו 25 microliters של פתרון אנזים. בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב פתרון מלאי התגובה ולהוסיף 10 microliters של 1.5 חומצה הידרוכלורית טוחנת צינור 1.5 מיליליטר המכיל 582 microliters של פתרון מלאי התגובה.לאחר מכן, להעביר את כל הנפח של פתרון מלאי התגובה וחומצה לצינור הבקרה אפס דקות בו זמנית ליזום ולהרוות את תגובת השליטה אפס דקות. שאפתן וחלוקת המדגם פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. ליזום ולהפעיל את שלוש התגובות הנותרות בצורה מזעזעת, מיד להעביר 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הניסוי הראשון ערבוב המדגם פעמיים כפי שהוכח רק.שאיפה זהירה וחלוקה מבטיחה ערבוב מלא במהלך שלבי החניכה. היו עקביים עם כל דגימה כדי להבטיח ערבוב דיפרנציאלי אינו משתנה. לאחר 30 שניות, להעביר 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הניסוי השני לערבב, ואחריו תוספת של עוד 582 microliters של פתרון מלאי התגובה לצינור הבקרה 30 דקות 30 שניות לאחר ייזום התגובה בצינור הניסוי השני.לאחר 30 דקות, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית 1.5-טוחן לצינור הניסוי הראשון, חוזרים על מרווה במרווחים של 30 שניות עבור צינורות הבקרה הניסיוניים השניים ו -30 דקות. כאשר כל התגובות כבר מרווה, להעביר 600 microliters של פתרון מכל תגובה צינורות NMR. כדי לחשב את המרת האחוזים של המצע עבור ספקטרום הבקרה, טען את הדגימות לספקטרומטר, אסוף את ספקטרום ה- NMR ו שכב את הספקטרום עבור הפקדים של אפס ו- 30 דקות.שנה את קנה המידה של אות המצע בפקד של אפס דקות כך שיתאימו לפקד של 30 דקות ושים לב לאחוז זה. לאחר מכן, חשב את המרת האחוזים כ- 100 פחות האחוז מהתאמת אותות המצע. כדי לחשב את ההמרה באחוזים של המצע לתגובות המכילות את תרכובת הבדיקה, שכב את הספקטרום לבקרה של אפס דקות ואת התגובה הראשונה המכילה את תרכובת הבדיקה 500 מיקרומולר וקנה מידה של אות המצע בפקד של אפס דקות כדי להתאים את הספקטרום עם תרכובת הבדיקה.שים לב לאחוז זה, ולהשתמש בו כדי לחשב את המרת האחוזים כפי שהודגם זה בלבד. לאחר מכן, שכב את הספקטרום לשליטה של אפס דקות ואת התגובה הראשונה המכילה את תרכובת הבדיקה 250 מיקרומולאר, וקנה מידה של אות המצע בשליטה של אפס דקות כדי להתאים את הספקטרום עם תרכובת הבדיקה. לאחר שים קץ לאחוז, השתמש בו כדי לחשב את המרת האחוזים.כדי לחשב את התגובה אחוז ועיכוב אחוז עבור כל ריכוז תרכובת בדיקה, הראשון, לחשב את התגובה אחוז כמו המרה אחוז של מתחם הבדיקה, מחולק על ידי המרה אחוז של פעמים הבקרה 100. לאחר מכן לחשב את עיכוב אחוז כמו 100 מינוס התגובה אחוז. כדי לבצע בדיקת מסך נגד חומר ניקוי, להוסיף 300 microliters של תחמוצת deuterium ו 25 microliters של פתרון אנזים לצינור 15 מיליליטר המכיל 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה.בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב את פתרון מלאי התגובה, ולהוסיף שני microliters של דטרגנט טריטון X-100 ל 20 מיליליטר של חיץ תגובה. לאחר מכן, הוסיפו 2.59 מיליליטר של חיץ תגובה, המכיל 0.01% חומר ניקוי טריטון X-100 לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 300 מיקרוליטרים של תחמוצת דיטריום ו-25 מיקרוליטרים של תוסף אנזים לצינור.בעדינות להפוך את הצינור פעמיים כדי לערבב פתרון מלאי התגובה. לאחר מכן, לקבוע את אחוז העיכוב עבור 100 מיקרומולר ו 50 מיקרומולרים תרכובות הבדיקה כפי שהוכח רק. שימוש בפתרון מלאי התגובה ללא חומר ניקוי, עבור קבוצה אחת של ארבעה צינורות ופתרון מלאי התגובה עם חומר ניקוי עבור קבוצה שנייה של ארבעה צינורות.כדי לבצע דילול קפיצה, להעביר 468 microliters של חיץ תגובה ו 60 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור המכיל 53.8 microliters של חיץ תגובה, חמישה microliters של פתרון אנזים, ו 1.2 microliters של DMSO כי כבר דגירה במשך 30 דקות. שאפו ופזרו את התערובת פעמיים בצורה איטית אך מכוונת. לפני העברת 468 microliters של חיץ תגובה ו 60 microliters של תחמוצת דיטריום לצינור המכיל 53.8 microliters של חיץ תגובה, חמישה microliters של פתרון אנזים, ו 1.2 microliters של תרכובת הבדיקה כי כבר דגירה במשך 30 דקות.מערבבים את התגובה השנייה פעמיים כפי שהוכח. ומיד להעביר 588 microliters של פתרון מצינור הבקרה DMSO דילול קפיצה לצינור המכיל 12 microliters של מצע עם ערבוב. המשך להעביר 588 מיקרוליטרים ממבחנה תרכובת תרכובת דילול קפיצה, צינור הבקרה DMSO לא מדולל, ואת צינור תרכובת הבדיקה undiluted לכל אחד משלושה צינורות 1.5 מיליליטר, המכיל 12 microliters של מצע לצינור עם ערבוב במרווחים של 30 שניות לאחר מכן.ואז לחכות 30 דקות לפני מרווה את התגובות, איסוף ספקטרום NMR, וחישוב עיכוב אחוז עבור כל תרכובת כפי שהוכח רק. כאן התוצאות לבדיקת שתי תרכובות נגד AgNH בבדיקה ראשונית תרכובת בדיקה באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח מוצגים. תגובת האנזים נצפית בקלות רבה וכמתה על ידי היעלמותו של סינגל אדנוסין ותהודה כפולה ב 8.48 ו 6.09 חלקים למיליון בהתאמה.ואת המראה של מגורים סינגל אדנין ב 8.33 חלקים למיליון כפי שנצפה בספקטרום הבקרה 30 דקות. בנתון זה, התוצאות לבדיקת תרכובת בשני ריכוזים נגד AgNH בבדיקה נגד מסך דטרגנט באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח מוצגים. רק הבדלים מינימליים נצפים בהתעצמות של אותות המצע והמוצר באמצעות שני התנאים, מה שמצביע על כך שעיכוב האנזים שנצפה אינו חפץ של צבירה מורכבת.שים לב כי תהודה הנובעת מהתרכובת שנבדקה וחומר הניקוי אינם מפריעים למצע או לתהודה של המוצר. התוצאות לבדיקת תרכובת בבדיקה דילול קפיצה נגד AGNH באמצעות פרוטון NMR כפי שהוכח לחשוף עוצמה מופחתת של אות המצע בתגובה 20 מיקרומולר לעומת התגובה 200 מיקרומולר, המציין כי העיכוב הוא הפיך. מדגם שלם ערבוב במהלך החניכה של כל תגובה עבור דילול קפיצה הוא קריטי.נדרשת שאיפה וחלוקה זהירות ועקביות. ניתן להשתמש ב- NMR גם כדי למדוד את פעילות האנזים בתאים שלמים, באמצעות פתרון המכיל תאים מושעים במקום מאגר התגובה והאנזים. מאמצי גילוי התרופות האנטי-טריכומונליות שלנו ממשיכים להסתמך על בדיקות אלה כדי למדוד את העוצמה של תרכובות מסונתזות חדשות נגד האנזימים ריבוהידרולאז.למרות שהוא משמש רק בכמויות קטנות מאוד, חומצה הידרוכלורית המשמשת כדי להתוות את התגובות הוא מסוכן ויש להשתמש בו עם ציוד מגן אישי הנכון.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

קביעת המישורים המחייבים קרח של חלבונים נגד קיפאון על ידי זיקה למטוס קרח מבוסס פלואורסצנטיות

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

נוקלאוזידים triphosphates - מ - סינתזה ביוכימיה באפיון

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Colorimetric Assay שמודד את הפעילות באופן ספציפי Granzyme B מפרקי חלבונים: הידרוליזה של הבוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylation מבחנים כדי לפענח את יחסי הגומלין בין סירטואינים (SIRT2) ו-מצעי חלבון מסוימים

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

אפיון, כימות מתחם ספציפי ניתוח איזוטופי של Pyrogenic פחמן שימוש בנזן Polycarboxylic חומצות (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

פלדיום<em&gt; N</em&gt; קומפלקסים Carbene heterocyclic: סינתזה מ Benzimidazolium מלחים ופעילות קטליטי פחמן פחמן בונד התגבשות התגובות

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...