Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

हम AgNH और UNH एंजाइमों प्रदान करने के लिए Astraeca टुकड़ा पुस्तकालय और डॉ डेविड Parkin से यौगिकों प्रदान करने के लिए डॉ डीन ब्राउन धन्यवाद. इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या R15AI128585 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था बी जे एस. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.अनुसंधान भी एक Horace जी McDonell ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप एस एन एम, एक Landesberg परिवार को सम्मानित द्वारा समर्थित किया गया था जे.ए.जी., और संकाय विकास अनुदान और फ्रेडरिक Bettelheim अनुसंधान पुरस्कार Adelphi विश्वविद्यालय से बी.जे.एस.

1. प्रारंभिक परीक्षण यौगिक 500 डिग्री सेल्सियस और 250 डिग्री मीटर पर परख
<ol><li>प्रतिक्रियाओं के लिए सब्सट्रेट और परीक्षण यौगिक तैयार करें।<ol>
<li>पानी में सब्सट्रेट (एडेनोसाइन या 5-फ्लोरोरिडीन) के स्टॉक समाधान त...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर कई एंजाइमों के लिए लागू होते हैं, बशर्ते कि substrates और / तथापि, यह महत्वपूर्ण है कि सब्सट्रेट की सांद्रता इसके केएम मूल्य के करीब है और एक उचित समय सीमा के भीतर एनएमआर प्रयो?...

नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी एंजाइम अभिक्रियाओं की विशेषता और निगरानी के लिए अच्छी तरह से स्थापित है1,2. रासायनिक बदलाव और युग्मन पैटर्न में अंतर सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों भेद करने के लिए उपयोग किया जाता है, और रिश्तेदार अनुनाद तीव्रता प्रतिक्रिया के प्रतिशत मात्रा में उपयोग किया जाता है। सब्सट्रेट की खपत और उत्पाद के निर्माण दोनों सीधे एनएमआर स्पेक्ट्रम में मनाया जाता है। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या फ्लोरोसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ यह विरोधाभास, जिसमें प्रतिक्रिया समय पाठ्यक्रम कुछ रासायनिक प्रजातियों का सेवन किया जा रहा है या बनाया जा रहा है के कारण अवशोषण में परिवर्तन द्वारा संकेत दिया है. बस के रूप में अन्य तरीकों के साथ, NMR तापमान, पीएच, या अन्य समाधान की स्थिति के एक समारोह के रूप में एंजाइम प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और inhibitors के प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है.
हाल ही में, NMR आधारित एंजाइम गतिविधि परख टुकड़ा स्क्रीनिंग3,4के लिए प्रदर्शन किया गया है. NMR आधारित परख आदर्श परीक्षण यौगिकों के उच्च सांद्रता पर काम करने के लिए उपयुक्त हैं (अक्सर के रूप में उच्च के रूप में 1 एमएम) इन कमजोर inhibitors का पता लगाने के लिए आवश्यक. NMR प्रयोग में गतिशील रेंज और रासायनिक बदलाव फैलाव आसानी से सब्सट्रेट, उत्पाद, और परीक्षण यौगिकों से अनुनादों को हल कर सकते हैं। यह स्पेक्ट्रोफोटोमिट्रिक परख के लिए अनुकूल तुलना करता है जहां पठन-आउट हस्तक्षेप समस्याएं अक्सर यूवी-विस अवशोषण प्रोफाइल के साथ यौगिकों से उत्पन्न होती हैं। इसके अलावा, के बाद से वे रिपोर्टर एंजाइमों की कमी, एकल एंजाइम NMR assays युग्मित-आश्चर्य झूठी सकारात्मक करने के लिए प्रवण नहीं हैं. यह लाभ उन्हें लंबकोणीय परख के रूप में उपयोगी बनाता है, पारंपरिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख और बेंचटॉप triage assays5पूरक.
हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला में, NMR आधारित गतिविधि परख की पहचान करने और Trichomonas योनि न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस के inhibitors का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है. टी योनि परजीवी सबसे प्रचलित गैर वायरल यौन संचारित रोग6का कारण बनता है. मौजूदा चिकित्सा7 के लिए बढ़ती प्रतिरोध उपन्यास के लिए की जरूरत ड्राइविंग है, तंत्र आधारित उपचार, आवश्यक न्यूक्लिओसाइड बचाव मार्ग एंजाइमों के साथ प्रमुख लक्ष्य8का प्रतिनिधित्व . एनएमआर-आधारित गतिविधि परख दोनों पायरिमिडीन- और प्यूरीन-विशिष्ट एंजाइमों के लिए विकसित की गई है, यूरिडीन न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस (यूएनएच)9, और एडेनोसाइन/गुआनोसाइन पसंद न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस (एजीएनएच)10. इन दोनों एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित अभिक्रियाएँ चित्र 1में दर्शायी गई हैं। एनएमआर परख रासायनिक प्रारंभिक बिंदुओं के लिए टुकड़ा पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण, और एकत्रीकरण आधारित या सहसंयोजक बंधन inhibitors11बाहर निराना. संपूर्ण कोशिकाओं में एंजाइम की गतिविधि का आकलन करने के लिए भी इसी परखों का अनुवाद किया जा रहाहै.
विस्तृत प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिओशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख. प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी एंजाइम है जिसमें सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों मनाया जा सकता है और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित करने के लिए लागू होते हैं। सादगी के लिए तीन अनुमान लगाए गए हैं। सबसे पहले, सब्सट्रेट निर्दिष्ट नहीं है। NMR आधारित गतिविधि assays के लिए उपयोगी होने के लिए, सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता से अधिक नहीं होना चाहिए 2-3x Km मान4. दिखाए गए उदाहरणों में एडेनोसाइन तथा 5-फ्लोरोरिडीन की अंतिम सांद्रताक्रमशः 100 उ (कउ र् 54 उ) तथा 50 उ (काउ ] 15 उ) होती है। प्रोटोकॉल में, इन सांद्रता को प्राप्त करने के लिए मेल खाती है 12 $L के 5 M एडेनोसिन या 2.5 m 5-fluororidine के 12 डिग्री एल.
दूसरा, प्रोटोकॉल में के लिए प्रदान की एंजाइम की मात्रा, 5 $L, 30 मिनट में उत्पाद के लिए सब्सट्रेट के लगभग 75% रूपांतरण में परिणाम के लिए आवश्यक राशि के अनुरूप करने के लिए चुना गया था. यह मात्रा आम तौर पर एक शुद्ध एंजाइम स्टॉक से एक बड़ी कमजोर पड़ने का प्रतिनिधित्व करता है, और कमजोर पड़ने प्रत्येक एंजाइम के लिए अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए. शुद्ध AGNH और UNH एंजाइम स्टॉक समाधान alicots में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है कि कई हजार प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त एंजाइम प्रदान करते हैं. इस प्रकार, कमजोर पड़ने कारक आदर्श केवल निर्धारित या हर कुछ महीनों में मान्य करने की जरूरत है. तीसरा, विशिष्ट 1D NMR प्रयोग निर्दिष्ट नहीं है. प्रतिनिधि परिणामों में, 1एच एनएमआर AGNH10 के लिए दिखाया गया है और 19एफ एनएमआर UNH9के लिए दिखाया गया है, एनएमआर प्रयोग के साथ इसी संदर्भ में वर्णित है. एनएमआर प्रयोग का चुनाव एंजाइम अभिक्रिया और उपलब्ध उपसंहरणों के साथ-साथ उपलब्ध एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है। अंत में, यह बताया जाना चाहिए कि वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण मात्रात्मक एनएमआर (क्यूएनएमआर)13,14की सख्त आवश्यकताओं का पालन नहीं करता है। प्रोटोकॉल में, एक प्रतिशत प्रतिक्रिया प्रत्येक स्पेक्ट्रम में एक ही अनुनाद की तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तन का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है, बजाय पूर्ण सांद्रता का निर्धारण करके. इस दृष्टिकोण डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण संशोधनों के साथ ही आंतरिक या बाहरी मानकों, जो QNMR के लिए आवश्यक हैं के लिए की आवश्यकता समाप्त.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी अक्सर पहचान और दवा की खोज में एंजाइम inhibitors की विशेषता के लिए प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से टुकड़ा स्क्रीनिंग के संदर्भ में. एनएमआर-आधारित गतिविधि परख आदर्श इन कमजोर अवरोधकों का पता लगाने के लिए आवश्यक परीक्षण यौगिकों की उच्च सांद्रता पर काम करने के लिए उपयुक्त हैं। एक NMR प्रयोग में गतिशील रेंज और रासायनिक बदलाव फैलाव आसानी से सब्सट्रेट, उत्पाद, और परीक्षण यौगिकों से अनुनादों को हल कर सकते हैं. स्पेक्ट्रोफोटोमिट्रिक परख के साथ यह विरोधाभास, जिसमें पढ़ने के बाहर हस्तक्षेप समस्याओं अक्सर ओवरलैपिंग यूवी-विस अवशोषण प्रोफाइल के साथ यौगिकों से उत्पन्न होते हैं। इसके अलावा, के बाद से वे रिपोर्टर एंजाइमों की कमी, एकल एंजाइम NMR assays युग्मित-आश्चर्य झूठी सकारात्मक करने के लिए प्रवण नहीं हैं. यह विशेषता उन्हें लंबकोणीय परख के रूप में उपयोगी बनाता है, पारंपरिक उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग परख और बेंचटॉप triage assays पूरक. विस्तृत प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिओशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख. तरीकों दो न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस एंजाइमों का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं। 1एच एनएमआर का उपयोग प्यूरीन-विशिष्ट एंजाइम के लिए दिखाया गया है, जबकि 19एफ एनएमआर को पाइरिमिडीन-विशिष्ट एंजाइम के लिए दिखाया गया है। प्रोटोकॉल आम तौर पर किसी भी एंजाइम जहां सब्सट्रेट और उत्पाद अनुनादों मनाया जा सकता है और NMR स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रतिष्ठित करने के लिए लागू होते हैं. दवा की खोज के संदर्भ में सबसे उपयोगी होने के लिए, सब्सट्रेट के अंतिम एकाग्रता से अधिक नहीं होना चाहिए 2-3x इसके Km मूल्य. एनएमआर प्रयोग का चुनाव एंजाइम अभिक्रिया और उपलब्ध उपसंहरणों के साथ-साथ उपलब्ध एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है।

चित्र 2 1एच एनएमआर निम्नलिखित अनुभाग 1 का उपयोग करके AGNH के विरुद्ध दो यौगिकों के परीक्षण के लिए परिणाम दिखाता है। एंजाइम अभिक्रिया को सबसे आसानी से देखा जाता है और एडेनोसाइन एकल और डबलेट अ?...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-आधारित क्रियाकलाप परख संमिश्र निषेध, आईसी50 मान, कृत्रिम गतिविधि, और न्यूक्लिओसाइड रिबोहाइड्रोलेस की संपूर्ण-कोशिका गतिविधि का निर्धारण करने के लिए

एनएमआर-आधारित गतिविधि परख दो न्यूक्लिओसाइड राइबोहाइड्रोलेस एंजाइमों के अवरोधकों की पहचान करने और उनकी विशेषता के लिए विकसित की गई है। प्रोटोकॉल 500 डिग्री और 250 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक यौगिक assays के लिए प्रदान की जाती हैं, आईसी50 मूल्यों का निर्धारण करने के लिए खुराक प्रतिक्रिया assays, डिटर्जेंट काउंटर स्क्रीन परख, कूद-डिल्यूशन काउंटर स्क्रीन परख, और ई. कोलाई पूरे कोशिकाओं में परख.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

डीएनए Glycosylase गतिविधि के लिए स्थिर राज्य, पूर्व स्थिर राज्य, और एकल कारोबार काइनेटिक मापन

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी द्वारा एंटीफ्रीज प्रोटीन के आइस-बाइंडिंग विमानों का निर्धारण

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

न्यूक्लीओसाइड Triphosphates - संश्लेषण से बायोकेमिकल विशेषता को

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

एक समर्थक प्रतिदीप्ति सब्सट्रेट एनालॉग के माध्यम से PAD4 गतिविधि के प्रतिदीप्ति आधारित निगरानी

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Boc-अला-अला-ASP-एस-Bzl की hydrolysis: एक वर्णमिति विशेष रूप से granzyme बी proteolytic गतिविधि उपाय है कि परख

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays sirtuins के बीच परस्पर क्रिया (SIRT2) और विशिष्ट प्रोटीन-substrates को जानने के लिए

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

लक्षण वर्णन, ज्वरकारक कार्बन बेंजीन polycarboxylic एसिड का उपयोग कर की मात्रा और यौगिक-विशिष्ट विश्लेषण समस्थानिक (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

एचपीएलसी आधारित परख मानव पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं में कोशिकी Nucleotide / nucleoside चयापचय नजर रखने के लिए

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

दुर्ग<em&gt; एन</em&gt; - हेटोसाइक्लिक कार्बेन कॉम्प्लेक्सः कार्बन-कार्बन बॉन्ड बनाने वाली प्रतिक्रियाओं में बेंज़िमिडाजोलियम साल्ट और कैटलिस्टिक गतिविधि से संश्लेषण

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

युगपत और माप के HDAC1 HeLa में HDAC6 गतिविधि कक्ष का उपयोग कर UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...