Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Ringraziamo il Dr. Dean Brown per aver fornito composti dalla libreria dei frammenti di Astra-eneca e dal Dr. David Parkin per aver fornito gli enzimi AGNH e UNH. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive dei National Institutes of Health con il numero di premio R15AI128585 a B. J. S. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.Research è stato sostenuto anche da una horace G. McDonell Summer Research Fellowship assegnata a S. N. M., una famiglia Landesberg Fellowship assegnato a J. A. G., e Faculty Development Grants e Frederick Bettelheim Research Award dall'Università di Adelphi a B. J. S.

1. Saggi composti di prova iniziali a 500 e 250 M
<ol><li>Preparare il substrato e testare il composto per le reazioni.<ol>
<li>Preparare soluzioni di stock di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) in acqua e composto di prova di 50 mM in solforo dimetilo deuterato (DMSO). Fare riferimento alla sezione introduttiva per le concentrazioni di soluzione di substrato da utilizzare.</li>
		<li>Aggiungere 12 l di substrato (adenosina o 5-fluorouridina) a ciascuno dei quattro tubi di microfuge da 1,5 ml, 1–4.</li>
		<li>Ag...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

I protocolli descritti sono generalmente applicabili a molti enzimi, a condizione che i substrati e/o i prodotti abbiano segnali risolvibili nello spettro NMR. Tuttavia, è fondamentale che la concentrazione di substrato sia vicina al suo valore Km e abbastanza elevata da essere rilevata in un esperimento NMR entro un lasso di tempo ragionevole. Una concentrazione di substrato non superiore a 2-3x il valore Km è ottimale per rilevare inibitori competitivi, non competitivi e non co...

La spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) è ben consolidata per caratterizzare e monitorare le reazioni enzimatiche1,2. Le differenze nei cambiamenti chimici e nei modelli di accoppiamento vengono utilizzate per distinguere le risonanze di substrato e prodotto, mentre le intensità di risonanza relativa vengono utilizzate per quantificare la percentuale di reazione. Sia il consumo di substrato che la creazione di prodotto sono osservati direttamente nello spettro NMR. Ciò contrasta con la spettrofotometria o la spettroscopia a fluorescenza, in cui il corso temporale di reazione è indicato da un cambiamento di assorbimento attribuibile ad alcune specie chimiche consumate o create. Proprio come con gli altri metodi, NMR può essere utilizzato per studiare le reazioni enzimatiche in funzione della temperatura, pH, o altre condizioni di soluzione, e gli effetti degli inibitori possono essere determinati.
Più recentemente, sono stati dimostrati i saggi di attività enzimatica basati su NMR per lo screening dei frammenti3,4. I saggi basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova (spesso fino a 1 mM) necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei turni chimici nell'esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo si confronta favorevolmente con i saggi spettrofotometrici in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo vantaggio li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta velocità e i saggi di triage da banco5.
Nel nostro laboratorio di ricerca, i saggi di attività basati su NMR vengono utilizzati per identificare e valutare gli inibitori di Trichomonas vaginalis nucleoside riboidrolasi. Il parassita T. vaginalis causa la malattia sessualmente trasmissibile non virale più diffusa6. La crescente resistenza alle terapie esistenti7 sta guidando la necessità di nuovi trattamenti basati su meccanismi, con enzimi essenziali del percorso di recupero nucleoside che rappresentano gli obiettivi principali8. Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR sia per gli enzimi specifici per la pirimidina che per la purina, per il riboidrolasi del nucleoto uridino (UNH)9e per l'adenosina/guanosina che preferiscono il riboidrolasi nucleoside (AGNH)10. Le reazioni catalizzate da questi due enzimi sono mostrate nella Figura 1. I saggi NMR vengono utilizzati per vagliare le librerie di frammenti per i punti di partenza chimici, determinare i valori IC50 e eserbare gli inibitori di legame basati sull'aggregazione o covalenti11. Gli stessi saggi vengono anche tradotti per valutare l'attività degli enzimi in intere cellule12.
Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservati e distinti dalla spettroscopia NMR. Sono state fatte tre ipotesi per semplicità. In primo luogo, il substrato non è specificato. Affinché i saggi di attività basati su NMR siano utili, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere superiore a 2-3 volte il valore Km 4. Negli esempi mostrati, le concentrazioni finali di adenosina e 5-fluorouridina sono rispettivamente 100 M (Km ) e 50 M (Km - 15 M ). Nei protocolli, il raggiungimento di queste concentrazioni corrisponde a 12 - L di 5 mM di adenosina o 12 L di 2,5 mM 5-fluorouridina.
In secondo luogo, è stata scelta la quantità di enzimi prevista nei protocolli, 5 L, per corrispondere alla quantità necessaria per ottenere circa il 75% di conversione del substrato in prodotto in 30 min. Questa quantità rappresenta in genere una grande diluizione da uno stock di enzimi purificato e la diluizione deve essere determinata in anticipo per ogni enzima. Le soluzioni di stock di enzimi Purificate AGNH e UNH sono immagazzinate a -80 gradi centigradi in aliquote che forniscono un enzima sufficiente per diverse migliaia di reazioni. Pertanto, il fattore di diluizione idealmente deve essere determinato o convalidato solo ogni pochi mesi. In terzo luogo, l'esperimento NMR 1D specifico non è specificato. Nei risultati rappresentativi, 1H NMR è indicato per AGNH10 e 19F NMR è indicato per UNH9, con l'esperimento NMR descritto nei riferimenti corrispondenti. La scelta dell'esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile. Infine, va sottolineato che l'approccio sperimentale descritto non aderisce ai severi requisiti del NMR quantitativo (qNMR)13,14. Nel protocollo, una reazione percentuale viene determinata utilizzando i cambiamenti relativi di intensità della stessa risonanza in ogni spettro, piuttosto che determinando le concentrazioni assolute. Questo approccio elimina la necessità di modifiche di acquisizione ed elaborazione dei dati, nonché gli standard interni o esterni, necessari per qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

La spettroscopia NMR viene spesso utilizzata per l'identificazione e la caratterizzazione degli inibitori degli enzimi nella scoperta di farmaci, in particolare nel contesto dello screening dei frammenti. I saggi di attività basati su NMR sono ideali per lavorare alle concentrazioni più elevate di composti di prova necessari per rilevare questi inibitori più deboli. La gamma dinamica e la dispersione dei cambiamenti chimici in un esperimento NMR possono facilmente risolvere le risonanze da substrati, prodotti e composti di prova. Questo contrasta con i saggi spettrofotometrici, in cui i problemi di interferenza di lettura spesso derivano da composti con profili di assorbimento UV-vis sovrapposti. Inoltre, poiché mancano di enzimi reporterschi, i test NMR a singolo enzima non sono inclini a falsi positivi accoppiati. Questo attributo li rende utili come saggi ortogonali, completando i tradizionali saggi di screening ad alta produttività e i saggi di triage da banco. Sono previsti protocolli dettagliati per i saggi composti iniziali a 500 m e 250 m, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi dello schermo del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-dilution e i saggi in E. coli intere cellule. I metodi sono dimostrati utilizzando due enzimi di riboidrolasi nucleoside. L'uso di 1H NMR è indicato per l'enzima specifico della purina, mentre 19F NMR è indicato per l'enzima specifico per la piromidine. I protocolli sono generalmente applicabili a qualsiasi enzima in cui il substrato e le risonanze dei prodotti possono essere osservate e distinte dalla spettroscopia NMR. Per essere il più utile nel contesto della scoperta di farmaci, la concentrazione finale del substrato non dovrebbe essere più di 2-3 volte il suo valore Km. La scelta dell'esperimento NMR dipende dalla reazione enzimatica e dai substrati disponibili, nonché dalla strumentazione NMR disponibile.

Nella figura 2 vengono illustrati i risultati per il test di due composti rispetto ad AGNH utilizzando 1H NMR seguendo la sezione 1. La reazione enzimatica è più facilmente osservabile e quantificata dalla scomparsa di risonzioni di adenosina singlet e doppietta a 8,48 ppm e 6,09 ppm, rispettivamente, e dalla comparsa di una risonanza singlet adenina a 8,33 ppm come osservato nel controllo di 30 min Spettro. In presenza di 500 m composto 1, nessun prodotto è formato come dimost...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Assaggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione composta, i valori IC50, l'attività Artifactual e l'attività intera delle cellule

Sono stati sviluppati saggi sull'attività NMR per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi riboidroelettrici nucleoside. I protocolli sono forniti per i saggi composti iniziali a 500 M e 250 M, i saggi di risposta alla dose per determinare i valori IC50, i saggi del controschermo del detergente, i saggi del controschermo jump-diluizione e i saggi in E. coli intere cellule.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

I test di attività basati su NMR forniscono un metodo efficace per identificare, valutare e convalidare gli inibitori per un determinato enzima. Sono particolarmente adatti per lo screening dei frammenti. I test NMR sono suscettibili alle concentrazioni composte più elevate richieste per gli inibitori più deboli.Inoltre, la mancanza di enzimi reporter li rende meno inclini a falsi positivi. Usiamo i test NMR nel nostro laboratorio per identificare e caratterizzare gli inibitori di due enzimi di Trichomonas vaginalis. Entrambi gli enzimi rappresentano nuovi bersagli per i nuovi farmaci anti-trichomonal.I test NMR sono generalmente applicabili a qualsiasi area di ricerca che coinvolge enzimi, e possono anche essere usati per studiare gli enzimi all'interno delle cellule. Gli aspetti più importanti della tecnica sono garantire che i volumi di reagente corretti siano pipettati e i componenti di reazione siano accuratamente miscelati. Per preparare il substrato e i composti di prova, aggiungere 12 microlitri di substrato a ciascuno dei quattro tubi di microfugo da 1,5 millilitri e aggiungere sei microlitri di DMSO deuterato al controllo zero minuti e tubi di controllo di 30 minuti.Aggiungere sei microlitri del composto di prova al primo tubo sperimentale e tre microlitri del composto di prova e tre microlitri di DMSO deuterato al secondo tubo sperimentale. Successivamente, aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio a un tubo da 15 millilitri contenente 2,59 millilitri di tampone di reazione, seguiti da 25 microlitri di soluzione enzimatica. Invertire delicatamente il tubo due volte per miscelare la soluzione del materiale di reazione e aggiungere 10 microlitri di acido cloridrico molare 1,5 a un tubo da 1,5 millilitri contenente 582 microlitri di soluzione di scorta di reazione.Quindi, trasferire l'intero volume della soluzione del materiale di reazione e dell'acido nel tubo di controllo di zero minuti per avviare e spegnere simultaneamente la reazione di controllo di zero minuti. Aspirare e erogare il campione due volte in modo lento ma deliberato. Avviare ed eseguire le restanti tre reazioni in modo scaglionato, trasferendo immediatamente 582 microlitri della soluzione del materiale di reazione al primo tubo sperimentale e mescolando il campione due volte come appena dimostrato.Un'attenta aspirazione e erogazione garantisce una miscelazione completa durante le fasi di iniziazione. Essere coerenti con ogni campione per garantire che la miscelazione differenziale non sia una variabile. Dopo 30 secondi, trasferire 582 microlitri di soluzione di scorta di reazione al secondo tubo sperimentale e miscelare, seguito dall'aggiunta di altri 582 microlitri di soluzione di stock di reazione al tubo di controllo di 30 minuti 30 secondi dopo aver iniziato la reazione nel secondo tubo sperimentale.Dopo 30 minuti, aggiungere 10 microlitri di acido cloridrico 1,5 molare al primo tubo sperimentale, ripetendo la tempra a intervalli di 30 secondi per i secondi tubi sperimentali e di controllo di 30 minuti. Una volta spente tutte le reazioni, trasferire 600 microlitri di soluzione da ogni reazione ai tubi NMR. Per calcolare la conversione percentuale del substrato per gli spettri di controllo, caricare i campioni sullo spettrometro, raccogliere gli spettri NMR e sovrapporre gli spettri per i controlli zero e 30 minuti.Ridimensionare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti in modo che corrisponda al controllo di 30 minuti e prendere nota di questa percentuale. Quindi, calcolare la conversione percentuale come 100 meno la percentuale dalla corrispondenza dei segnali del substrato. Per calcolare la conversione percentuale del substrato per le reazioni contenenti il composto di prova, sovrapporre gli spettri per il controllo di zero minuti e la prima reazione contenente il composto di prova da 500 micromolare e scalare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti in modo che corrisponda allo spettro con il composto di prova.Si noti questa percentuale e utilizzarla per calcolare la conversione percentuale come appena dimostrato. Quindi, sovrapporre gli spettri per il controllo di zero minuti e la prima reazione contenente il composto di prova da 250 micromolari e scalare il segnale del substrato nel controllo di zero minuti per abbinare lo spettro al composto di prova. Dopo aver annotato la percentuale, utilizzarla per calcolare la conversione percentuale.Per calcolare la reazione percentuale e l'inibizione percentuale per ogni concentrazione del composto di prova, in primo luogo, calcolare la reazione percentuale come conversione percentuale del composto di prova, divisa per la conversione percentuale del controllo per 100. Quindi calcola l'inibizione percentuale come 100 meno la reazione percentuale. Per eseguire un test dello schermo del contatore del detergente, aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio e 25 microlitri di soluzione enzimatica a un tubo da 15 millilitri contenente 2,59 millilitri di tampone di reazione.Invertire delicatamente il tubo due volte per mescolare la soluzione del materiale di reazione e aggiungere due microlitri di detersivo Triton X-100 a 20 millilitri di tampone di reazione. Quindi, aggiungere 2,59 millilitri di tampone di reazione, contenenti 0,01%Triton X-100 detergente a un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Quindi aggiungere 300 microlitri di ossido di deuterio e 25 microlitri di soluzione enzimatica al tubo.Invertire delicatamente il tubo due volte per mescolare la soluzione del materiale di reazione. Quindi, determinare l'inibizione percentuale per i composti di prova da 100 micromolari e 50 micromolari come appena dimostrato. Utilizzo della soluzione del materiale di reazione senza detergente, per un set di quattro tubi e della soluzione del materiale di reazione con detergente per un secondo set di quattro tubi.Per eseguire una diluizione del salto, trasferire 468 microlitri di tampone di reazione e 60 microlitri di ossido di deuterio in un tubo contenente 53,8 microlitri di tampone di reazione, cinque microlitri di soluzione enzimatica e 1,2 microlitri di DMSO che ha incubato per 30 minuti. Aspirare e erogare la miscela due volte in modo lento, ma deliberato. Prima di trasferire 468 microlitri di tampone di reazione e 60 microlitri di ossido di deuterio in un tubo contenente 53,8 microlitri di tampone di reazione, cinque microlitri di soluzione enzimatica e 1,2 microlitri di composto di prova che ha incubato per 30 minuti.Mescolare la seconda reazione due volte come dimostrato. E trasferire immediatamente 588 microlitri di soluzione dal tubo di controllo DMSO di diluizione al salto a un tubo contenente 12 microlitri di substrato con miscelazione. Continuare a trasferire 588 microlitri dalla provetta di diluizione del salto, dal tubo di controllo DMSO non diluito e dalla provetta non diluita a ciascuno dei tre tubi da 1,5 millilitri, contenenti 12 microlitri di substrato per tubo con miscelazione a intervalli di 30 secondi in seguito.Quindi attendere 30 minuti prima di spegnere le reazioni, raccogliere gli spettri NMR e calcolare l'inibizione percentuale per ogni composto come appena dimostrato. Qui vengono mostrati i risultati per testare due composti contro AgNH in un test del composto di prova iniziale usando il protone NMR come dimostrato. La reazione enzimatica è più facilmente osservabile e quantificata dalla scomparsa delle risonanze di adenosina singlet e doublet rispettivamente a 8,48 e 6,09 parti per milione.E la comparsa di una residenza singlet adenina a 8,33 parti per milione come osservato nello spettro di controllo di 30 minuti. In questa figura, vengono mostrati i risultati per testare un composto a due concentrazioni contro AgNH in un test detergente contro-schermo usando il protone NMR come dimostrato. Si osservano solo differenze minime nelle intensità del substrato e dei segnali del prodotto utilizzando le due condizioni, indicando che l'inibizione enzimatica osservata non è un artefatto di aggregazione composta.Si noti che le risonanze derivanti dal composto testato e dal detergente non interferiscono con le risonanze del substrato o del prodotto. I risultati per testare un composto in un saggio di diluizione del salto contro AGNH utilizzando il protone NMR come dimostrato rivelano una ridotta intensità del segnale del substrato nella reazione 20-micromolare rispetto alla reazione di 200 micromolare, indicando che l'inibizione è reversibile. Una miscelazione completa del campione durante l'inizio di ogni reazione e per le diluizioni di salto è fondamentale.È necessaria un'aspirazione e un'erogazione attente e coerenti. I test basati su NMR possono anche essere utilizzati per misurare l'attività enzimatica in intere cellule, utilizzando una soluzione contenente cellule sospese al posto del tampone di reazione e dell'enzima. I nostri sforzi di scoperta di farmaci anti-trichomonal continuano a fare affidamento su questi test per misurare la potenza dei composti appena sintetizzati rispetto agli enzimi riboidrolasi.Anche se viene utilizzato solo in piccole quantità, l'acido cloridrico utilizzato per placare le reazioni è pericoloso e dovrebbe essere utilizzato con i dispositivi di protezione individuale adeguati.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Ricerca

Chimica

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleosidi trifosfati - Dalla sintesi di biochimica Caratterizzazione

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

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Deacetilazione saggi di svelare l&#39;interazione tra sirtuine (SIRT2) e specifici Protein-substrati

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

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Caratterizzazione, quantificazione e specifici Compound isotopica analisi di Pirogenica di carbonio utilizzando Benzene Polycarboxylic Acidi (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

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Palladio<em&gt; N</em&gt; Complessi di Carbene eterocicliche: Sintesi dei sali di benzimidazolium e attività catalitica in reazioni di formazione di legame di carbonio-carbonio

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...