Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

アストラゼネカフラグメントライブラリーから化合物を提供してくれたディーン・ブラウン博士と、AGNHとUNH酵素を提供してくれたデビッド・パーキン博士に感謝します。この出版物で報告された研究は、B.J.S.に賞番号R15AI128585の下で国立衛生研究所のアレルギーと感染症の国立研究所によってサポートされました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではなく、ランデスバーグ家であるS.N.M.に授与されたホレイス・G・マクドネル・サマー・リサーチ・フェローシップによっても支持された。フェローシップは、J.A.G.、およびアデルフィ大学からB.J.S.に対する教員開発助成金とフレデリック・ベッテルハイム研究賞を授与されました。

1. 500 μM および 250 μM の初期試験化合物アッセイ
<ol><li>反応用の基板および試験化合物を調調します。<ol>
<li>水中の基質(アデノシンまたは5-フルオロリジン)のストック溶液と、過熱ジメチルスルホキシド(DMSO)中の50mM試験化合物を調製する。使用する基板溶液の濃度については、導入セクションを参照してください。</li>
		<li>4つの1.5 mLマイクロフュージチューブ、1-4のそれぞれに基板(アデ?...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

記載されているプロトコルは、基質および/または製品がNMRスペクトル内で解決可能なシグナルを有することを条件として、一般に多くの酵素に適用可能である。しかし、基板の濃度がKm値に近く、合理的な時間枠内のNMR実験で検出されるほど高いことがわかります。2-3倍以下の基板濃度Km値は、競争力のある非競争的、競争力のない阻害剤4を検...

核磁気共鳴(NMR)分光法は、酵素反応1、2を特徴付けおよび監視するために十分に確立されている。化学シフトと結合パターンの違いは、基板と製品の共振を区別するために使用され、相対共振強度は反応のパーセントを定量化するために使用されます。基板の消費と製品の作成の両方がNMRスペクトルで直接観察されます。これは分光光法または蛍光分光法とは対照的であり、反応時間の経過は、消費または作成されるいくつかの化学種に起因する吸光度の変化によって示される。他の方法と同様に、NMRは、温度、pH、または他の溶液条件の関数として酵素反応を研究するために使用することができ、阻害剤の効果を決定することができます。
さらに最近では、NMRベースの酵素活性アッセイは、フラグメントスクリーニング3、4について実証されている。NMRベースのアッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要な高濃度の試験化合物(多くの場合、1mMと同じくらい高い)で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、読み出し干渉の問題が多くUV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から生じる分光光アッセイと比較します。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この利点は、それらが直交アッセイとして有用になり、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイ5を補完する。
当研究室では、NMRベースの活性アッセイを用いて、トリコモナス膣ヌクレオシドリボヒドロラーゼの阻害剤を同定し、評価しています。T.膣寄生虫は、最も一般的な非ウイルス性感染症6を引き起こす。既存の治療法7に対する耐性の増加は、主要な標的8を表す必須ヌクレオシドサルベージ経路酵素を有する新規なメカニズムベースの治療の必要性を促進している。NMRベースの活性アッセイは、ピリミジンおよびプリン特異的酵素、ウリジンヌクレオシドリボヒドロラーゼ(UNH)9、およびアデノシン/グアノシンがヌクレオシドリボヒドロラーゼ(AGNH)10を好む両方のために開発された。これら2つの酵素によって触媒された反応を図1に示す。NMRアッセイは、化学的開始点のフラグメントライブラリをスクリーニングし、IC50値を決定し、集約ベースまたは共生結合阻害剤11を除離するために使用されている。同じアッセイはまた、全細胞12における酵素活性を評価するために翻訳されている。
詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。わかりやすくするために、3 つの仮定がなされています。まず、基板は指定されません。NMRベースの活性アッセイが有用である場合、基板の最終濃度はKm値4の2〜3倍以下であるべきである。示されている実施例では、アデノシンおよび5-フルオロリジンの最終濃度はそれぞれ100μM(K m= 54 μM)および50 μM(Km = 15 μM)である。プロトコルでは、これらの濃度を達成することは、5mMアデノシンの12 μLまたは2.5mM 5-フルオロリジンの12 μLに相当する。
第2に、プロトコルに提供される酵素の量は、5μL、30分で基板から製品への約75%の変換をもたらすのに必要な量に対応するように選択した。この量は、通常、精製酵素ストックからの大きな希釈を表し、希釈は、各酵素のために事前に決定する必要があります。精製されたAGNHおよびUNH酵素ストック溶液は、数千の反応に十分な酵素を提供するアリコートで-80°Cで保存されます。したがって、希釈係数は、理想的には数ヶ月ごとに決定または検証する必要があります。第3に、特定の1D NMR実験は指定されていない。代表的な結果では、AGNH10および19 F NMRに対して1H NMRが示され、対応する参考文献に記載されたNMR実験が示されている。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。最後に、記載された実験アプローチが定量的NMR(qNMR)13,14の厳密な要件に従わないことを指摘すべきである。プロトコルでは、パーセント反応は、絶対濃度を決定するのではなく、各スペクトルにおける同じ共振の強度の相対的な変化を使用して決定される。このアプローチにより、qNMRに必要な内部規格や外部規格と同様に、データの取得と処理の変更が不要になります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR分光法は、創薬における酵素阻害剤の同定および特徴付けにしばしば用いられ、特に断片スクリーニングの文脈において使用される。NMRベースの活性アッセイは、これらの弱い阻害剤を検出するために必要なより高濃度の試験化合物で働くのに理想的に適しています。NMR実験におけるダイナミックレンジと化学シフト分散により、基板、製品、試験化合物からの共振を容易に解決できます。これは、UV-vis吸収プロファイルが重複する化合物から読み出し干渉の問題がしばしば生じる分光光測定アッセイとは対照的です。また、レポーター酵素が不足しているため、単酵素NMRアッセイは結合アッセイ偽陽性を起こしにくい。この属性は、従来の高スループットスクリーニングアッセイおよびベンチトップトリアージアッセイを補完する直交アッセイとして有用になります。詳細なプロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞におけるアッセイのために提供されます。これらの方法は、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素を用いて実証される。プリン特異的酵素に対して1H NMRの使用が示され、19F NMRはピリミジン特異的酵素に対して示されている。 プロトコルは、一般に、基質と製品の共鳴がNMR分光法によって観察および区別される任意の酵素に適用可能である。創薬の文脈で最も有用になるために、基板の最終的な濃度は、そのKm値の2〜3倍以下でなければなりません。 NMR実験の選択は、利用可能な酵素反応と基板、ならびに利用可能なNMR計測に依存する。

図2は、セクション1に続く1H NMRを用いてAGNHに対して2つの化合物を試験した結果を示す。酵素反応は、それぞれ8.48 ppmおよび6.09 ppmでアデノシンシングルトとダブルト共鳴の消失によって最も容易に観察され、定量され、30分コントロールで観察される8.33 ppmのアデニンシングルト共鳴の出現スペクトル。500 μM化合物1の存在下では、8.33 ppmでのアデニン共鳴の欠如?...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

化合物阻害、IC50値、アーティフィファクト活性、ヌクレオシドリボヒドロラーゼの全細胞活性を決定するためのNMRベース活性アッセイ

NMRベースの活性アッセイは、2つのヌクレオシドリボヒドロラーゼ酵素の阻害剤を同定し、特徴付けるために開発された。プロトコルは、500 μMおよび250 μMの初期化合物アッセイ、IC50値を決定するための用量応答アッセイ、洗剤カウンタースクリーンアッセイ、ジャンプ希釈カウンタースクリーンアッセイ、および大腸菌全細胞のアッセイのために提供されます。

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMRベースの活性アッセイは、特定の酵素に対する阻害剤を同定、評価、検証するための効果的な方法を提供します。それらは断片スクリーニングのために特に適している。NMRアッセイは、弱い阻害剤に必要な高い化合物濃度に適しています。さらに、レポーター酵素の欠如は、偽陽性を起こしにくい。私たちは、研究室のNMRアッセイを使用して、トリコモナス膣から2つの酵素の阻害剤を同定し、特徴付けます。両方の酵素は、新しい抗トリコモナル薬の新しい標的を表す。NMRアッセイは、一般的に酵素を含む研究の任意の領域に適用され、細胞内の酵素を研究するために使用することができます。この技術の最も重要な側面は、正しい試薬の容積がピペット化され、反応成分が完全に混合されていることを確認することです。基質および試験化合物を調製するには、4つの1.5ミリリットルマイクロフュージチューブのそれぞれに12マイクロリットルの基質を加え、6マイクロリットルの重水素DMSOをゼロ分制御チューブと30分制御チューブに加えます。試験化合物の6マイクロリットルを第1実験管に加え、試験化合物の3マイクロリットル、および3マイクロリットルの重水素DMSOを第2の実験管に加える。次に、2.59ミリリットルの反応バッファーを含む15ミリリットルのチューブに300マイクロリットルの重水素酸化物を加えた後、25マイクロリットルの酵素溶液を添加します。チューブを2回そっと反転して反応ストック溶液を混合し、582マイクロリットルの反応ストック溶液を含む1.5ミリリットルチューブに1.5モル塩酸10マイクロリットルを加えます。次に、反応ストック溶液と酸の全量をゼロ分制御チューブに移し、ゼロ分制御反応を同時に開始および焼入する。サンプルをゆっくりと意図的に2回吸引し、分配する。残りの3つの反応をずらして開始して実行し、すぐに582マイクロリットルの反応ストック溶液を最初の実験チューブに移し、サンプルを2回混合します。慎重な吸引と分配は開始のステップの間に完全な混合を保障する。各サンプルと一致して、差分混合が変数ではないことを確認します。30秒後、反応ストック溶液582マイクロリットルを第2実験チューブに移し、その後、第2実験管で反応を起動させた30秒後に、反応ストック溶液を30分間制御チューブに添加した。30分後、1番目の実験管に1.5モル塩酸の10マイクロリットルを加え、2番目の実験および30分間の制御チューブのために30秒間隔で消光を繰り返す。すべての反応が消灯されたら、各反応から600マイクロリットルの溶液をNMRチューブに移します。制御スペクトルの基板の変換率を計算するには、サンプルを分光計にロードし、NMRスペクトルを収集し、ゼロと30分の制御のスペクトルをオーバーレイします。ゼロ分制御で基板信号をスケーリングして、30分の制御に合わせ、この割合を記録します。次に、変換率を、基板信号の照合から百分率を引いた100として計算する。試験化合物を含む反応に対する基質の転率を算出するために、500マイクロモル試験化合物を含む第1の反応とゼロ分制御のためのスペクトルを重ね、ゼロ分制御で基質信号をスケールして、スペクトルを試験化合物と一致させる。この割合をメモし、この割合を使用して、単に示したように、パーセント変換を計算します。次に、250マイクロモル試験化合物を含むゼロ分制御及び第1の反応に対するスペクトルを重ね、ゼロ分制御で基質信号をスケールして、試験化合物とスペクトルを一致させる。パーセントを確認したら、パーセント変換を計算します。各試験化合物濃度に対する反応率及び阻害率を算出するために、まず、試験化合物の転化率として反応率を算出し、制御倍率100の割合換算で割った。次に、パーセント阻害率を100から反応率を引いた値として計算します。洗剤カウンタースクリーンアッセイを実行するには、2.59ミリリットルの反応バッファーを含む15ミリリットルのチューブに300マイクロリットルの重水素酸化物と25マイクロリットルの酵素溶液を加えます。チューブを2回軽く反転して反応ストック溶液を混合し、20ミリリットルの反応バッファーにTriton X-100洗剤を2マイクロリットル加えます。次に、0.01%トリトンX-100洗剤を含む2.59ミリリットルの反応バッファーを新しい15ミリリットル円錐形チューブに加えます。次に、300マイクロリットルの重水素酸化物と25マイクロリットルの酵素溶液をチューブに加えます。チューブを2回軽く反転させ、反応ストック溶液を混合します。次に、100マイクロモルおよび50マイクロモル試験化合物に対する阻害率を、ちょうど実証したように決定する。洗浄剤を含まない反応ストック溶液を用いて、4本のチューブの1セットと、4本のチューブの2セット目に対する洗浄剤付き反応ストック溶液を使用する。ジャンプ希釈を行うために、反応バッファー468マイクロリットルと60マイクロリットルの重水素酸化物を53.8マイクロリットルの反応バッファー、5マイクロリットルの酵素溶液、および30分間インキュベートされた1.2マイクロリットルのDMSOを含むチューブに移します。吸引し、ゆっくりと、しかし意図的な方法で混合物を2回分配する。468マイクロリットルの反応バッファーと60マイクロリットルの重水素酸化物を、53.8マイクロリットルの反応バッファー、5マイクロリットルの酵素溶液、および30分間インキュベートされた1.2マイクロリットルの試験化合物を含むチューブに移す前。2回目の反応を実演に合わせて2回混ぜる。そして、すぐに588マイクロリットルの溶液を、ジャンプ希釈DMSO制御チューブから、混合して12マイクロリットルの基板を含むチューブに移す。ジャンプ希釈試験用化合物チューブ、希釈されていないDMSO制御チューブ、および希釈されていない試験化合物チューブから3つの1.5ミリリットルチューブのそれぞれに588マイクロリットルを移し、その後30秒間隔で混合してチューブあたり12マイクロリットルの基板を含みます。次に、反応を焼き付ける前に30分待ち、NMRスペクトルを収集し、ちょうど実証したように各化合物の阻害率を計算する。ここで実証したようにプロトンNMRを用いた初期試験化合物アッセイでAgNHに対して2つの化合物を試験した結果が示される。酵素反応は、アデノシンシングルの消失と100万分の6.09部のアデノシンの単振れと6.09部のそれぞれで最も容易に観察され、定量化される。そして、30分間の制御スペクトルで観察された100万分あたり8.33部のアデニンシングルレジデンスの出現。この図では、図示したようにプロトンNMRを用いた洗浄剤対スクリーンアッセイにおいてAgNHに対して2濃度の化合物を試験した結果が示されている。この2つの条件を用いて基質及び生成シグナルの強度において最小の差のみが認められ、観察された酵素阻害が化合物凝集のアーチファクトではないことを示す。なお、試験化合物および洗剤から生じる共鳴は、基質または製品の共振に干渉しないことに注意してください。デモのようにプロトンNMRを用いたAGNHに対するジャンプ希釈アッセイで化合物を試験した結果は、200マイクロモル反応と比較して20マイクロモル反応における基質シグナルの強度低下を明らかにし、阻害が可逆的であることを示す。各反応の開始時およびジャンプ希釈のための完全なサンプル混合は重要である。慎重かつ一貫した願望と分配が必要です。NMRベースのアッセイは、反応バッファーおよび酵素の代わりに中断された細胞を含む溶液を用いて、細胞全体の酵素活性を測定するために使用することもできる。抗トリコモナル創薬の取り組みは、リボヒドロラーゼ酵素に対する新たに合成された化合物の効力を測定するために、これらのアッセイに依存し続けている。それは非常に少量で使用されているにもかかわらず、反応を急いで使用される塩酸は危険であり、適切な個人的な保護具と一緒に使用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

のBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlのの加水分解：具体的にグランザイムBタンパク質分解活性を測定する比色アッセイ

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

脱アセチル化アッセイは、サーチュインの間にInterplay（SIRT2）と特異的なタンパク質 - 基質を解明します

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

特徴づけ、定量化およびベンゼンポリカルボン酸を使用した熱分解炭素の化合物固有の同位体分析（BPCA）

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLCベースのアッセイは、ヒト慢性リンパ球性白血病細胞における細胞外ヌクレオチド/ヌクレオシド代謝を監視します

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

パラジウム<em&gt; N</em&gt; - 複素環カルベン錯体：ベンズイミダゾリウム塩からの合成と炭素 - 炭素結合形成反応における触媒活性

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...