Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
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아스트라제네카 단편 라이브러리에서 화합물을 제공한 딘 브라운 박사와 AGNH 및 UNH 효소를 제공한 데이비드 파친 박사에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 B. J. S에 상 번호 R15AI128585의 밑에 건강의 국가 학회의 알레르기그리고 감염증의 국가 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.연구 는 또한 Horace G. McDonell 여름 연구 펠로우십에 의해 지원되었다 S. N. M., Landesberg 가족 J. A. G., 교수 개발 보조금 및 아델피 대학에서 B. J. S에 프레드릭 베텔하임 연구 상수여.

1. 500 μM 및 250 μM에서 초기 시험 화합물 검아
<ol><li>반응에 대한 기판 및 테스트 화합물을 준비합니다.<ol>
<li>디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 물 속기(아데노신 또는 5-플루오루리딘)와 50 mM 시험 화합물의 재고 용액을 준비합니다. 사용할 기판 용액의 농도에 대한 소개 섹션을 참조하십시오.</li>
		<li>기질 12 μL (아데노신 또는 5-플루오루리딘)을 각각 4 개의 1.5 mL 마이크로 퍼지 튜브, 1-4에 추가합니다....

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

기질 및/또는 제품이 NMR 스펙트럼에서 용해 가능한 신호를 가지고 있는 경우, 설명된 프로토콜은 일반적으로 많은 효소에 적용가능하다. 그러나, 기판의 농도가 그 Km 값에 가깝고 합리적인 기간 내에 NMR 실험에서 검출될 수 있을 만큼 충분히 높다는 것이 중요하다. 기판 농도가 2-3배 이하인 Km 값은 경쟁력, 비경쟁성 및 비경쟁 억제제 4를 검출하는 데 최적입니다.<sup c...

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 효소 반응을 특성화하고 모니터링하기위한 잘 확립되어 있습니다 1,2. 화학 적 변화와 커플링 패턴의 차이는 기판과 제품 공명을 구별하는 데 사용되며 상대 공명 강도는 반응의 백분율을 정량화하는 데 사용됩니다. 기판의 소비와 제품의 생성은 모두 NMR 스펙트럼에서 직접 관찰된다. 이는 분광광도법 또는 형광 분광법과 대조되는데, 반응 시간 과정은 일부 화학 종에 기인하는 흡광도의 변화로 인해 소비되거나 생성됩니다. 다른 방법과 마찬가지로 NMR은 효소 반응을 온도, pH 또는 다른 용액 조건의 함수로 연구하는 데 사용할 수 있으며 억제제의 효과를 결정할 수 있습니다.
보다 최근에는, NMR 계 효소 활성 성검사가 단편 스크리닝 3,4에대해 입증되었다. NMR 기반 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물(종종 1mMM)의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 생성물 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 유리하게 비교됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이러한 장점은 기존의 높은 처리량 선별 검문 및 벤치탑 심사 검문 5를 보완하는 직교 검문 검사로 유용하게 만듭니다.
우리의 연구 실험실에서, NMR 기지를 둔 활동 시험은 트리코모나스 질 핵핵리보하이드라제의 억제제기준을 확인하고 평가하기 위하여 이용됩니다. 상기 T. 질성 기생충은 가장 널리 퍼진 비바이러스성 성병6을일으킨다. 기존 치료법에 대한 저항성 증가 7은 주요 표적을 나타내는 필수 뉴클레오시드 인양 경로 효소와 함께 새로운 메커니즘 기반 치료법에 대한 필요성을 주도하고있다8. NMR 기반 활성 세포는 피리미딘- 및 푸린 특이적 효소, 우리딘 뉴클레오시드 리보하이드라제(UNH)9,및 아데노신/구아노신을 선호하는 뉴클레오시드 리보하이드로라제(AGNH)10모두에 대해 개발되었다. 이 두 효소에 의해 촉매작용된 반응은 그림1에 나타내었다. NMR 분석을 사용하여 화학적 시작점에 대한 단편 라이브러리를 스크리팅하고, IC50 값을 결정하고, 응집기반 또는 공유 결합 억제제(11)를 잡초아웃한다. 동일한 아세이역시 전체 세포에서 효소 활성을 평가하기 위해 번역되고있다 12.
상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 단순성에 대한 세 가지 가정이 만들어졌습니다. 첫째, 기판은 지정되지 않는다. NMR 기반 활성 반응의 유용성을 위해, 기판의 최종 농도는 Km 값 4의2-3배 이하이어야 한다. 도시된 예에서, 아데노신 및 5-플루오로우리딘의 최종 농도는 각각 100 μM(Km = 54 μM) 및 50 μM(Km= 15 μM)이다. 프로토콜에서, 이들 농도를 달성하는 것은 5 mM 아데노신의 12 μL 또는 2.5 mM 5-플루오루리딘의 12 μL에 해당한다.
둘째, 프로토콜에 제공된 효소의 양은 5 μL로, 30분 내에 기질의 약 75% 변환을 초래하는 데 필요한 양에 대응하기 위해 선택되었다. 이러한 양은 전형적으로 정제된 효소 스톡으로부터 큰 희석을 나타내며, 희석은 각 효소에 대해 미리 결정되어야 한다. 정제된 AGNH 및 UNH 효소 스톡 용액은 수천 개의 반응에 충분한 효소를 제공하는 양현표에 -80°C에 저장됩니다. 따라서, 희석 계수는 이상적으로 단지 몇 개월마다 결정되거나 검증될 필요가 있다. 셋째, 특정 1D NMR 실험은 지정되지 않았다. 대표적인 결과에서, 1H NMR은 UNH 9에 대해 도시된 AGNH10 및 19F NMR에 대해 도시되며, 해당 참조에 기재된 NMR 실험과 함께 도시된다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다. 마지막으로, 설명된 실험 접근법이 정량적 NMR(qNMR)13,14의엄격한 요건을 준수하지 않는다는 점을 지적해야 한다. 프로토콜에서 백분율 반응은 절대 농도를 결정하는 것이 아니라 각 스펙트럼에서 동일한 공진의 강도의 상대적 변화를 사용하여 결정됩니다. 이 방법을 사용하면 qNMR에 필요한 내부 또는 외부 표준뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리 수정이 필요하지 않습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR 분광법은 약물 발견에서 효소 억제제의 식별 및 특성화, 특히 단편 스크리닝의 맥락에서 종종 사용됩니다. NMR 기반 활성 측정은 이러한 약한 억제제를 검출하는 데 필요한 시험 화합물의 고농도에서 작업하는 데 이상적입니다. NMR 실험에서 다이나믹 레인지및 화학적 시프트 분산은 기판, 제품 및 테스트 화합물의 공명을 쉽게 해결할 수 있습니다. 이는 UV-vis 흡수 프로파일이 겹치는 화합물에서 판독 간섭 문제가 종종 발생하는 분광광도 측정 분석과 대조됩니다. 또한, 리포터 효소가 부족하기 때문에, 단일 효소 NMR 분석법은 결합-분석 거짓 양성에 취약하지 않다. 이 속성은 전통적인 높은 처리량 검열 검문 및 벤치탑 분류 검문 검사를 보완하는 직교 검문 검사로 그(것)들을 유용하게 합니다. 상세한 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다. 이 방법은 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소를 사용하여 입증된다. 1H NMR의 사용은 푸린 특이적 효소에 대해, 19F NMR은 피리미딘 특이적 효소에 대해 나타난 다. 프로토콜은 일반적으로 기질 및 생성물 공진이 NMR 분광법에 의해 관찰되고 구별될 수 있는 모든 효소에 적용됩니다. 약물 발견의 맥락에서 가장 유용하게 사용하려면, 기판의 최종 농도는 Km 값의 2-3 배 이상이어야한다. NMR 실험의 선택은 사용 가능한 효소 반응 및 기질뿐만 아니라 사용 가능한 NMR 계측에 달려 있습니다.

도 2는 1H NMR을 사용하여 AGNH에 대하여 2개의 화합물을 시험한 결과를 다음 섹션 1을 나타낸다. 효소 반응은 각각 8.48 ppm 및 6.09 ppm에서 아데노신 싱글트와 더블음 공진의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰및 정량화되고, 30분 대조군에서 관찰된 바와 같이 8.33 ppm에서 아데닌 싱글t 공진의 출현 스펙트럼. 500 μM 화합물 1의 존재에서, 어떤 생성물도 8.33 ppm에서 아데닌 공명의 부...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

화합물 억제, IC50 값, 관절 활성 및 뉴클레오시드 리보하이드라제의 전세포 활성을 결정하기 위한 NMR 기반 활성 반응

NMR 기반 활성 세포는 2개의 뉴클레오시드 리보하이드로라제 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 개발되었다. 프로토콜은 500 μM 및 250 μM에서 초기 화합물 분석, IC50 값, 세제 카운터 스크린 분석, 점프 희석 카운터 스크린 분석, 및 대장균 전체 세포에서 분석법을 결정하기 위한 투여 량 반응 분석법을 위해 제공된다.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR 기반 활성 작용법은 주어진 효소에 대한 억제제의 식별, 평가 및 유효성을 검사하는 효과적인 방법을 제공합니다. 그들은 특히 단편 스크리닝에 적합합니다. NMR 아세약은 약한 억제제에 필요한 더 높은 화합물 농도에 순종한다.또한, 기자 효소의 부족은 그(것)들을 거짓 긍정에 보다 적게 수그립니다. 우리는 트리코모나스 질에서 두 효소의 억제제를 식별하고 특성화하기 위해 실험실에서 NMR 애서를 사용합니다. 두 효소모두 새로운 항-트리코모날 약물에 대한 새로운 표적을 나타냅니다.NMR 어약은 일반적으로 효소를 관련시키는 연구의 모든 분야에 적용되며 세포 내부의 효소를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술의 가장 중요한 측면은 올바른 시약 볼륨이 파이펫화되고 반응 구성 요소가 철저히 혼합되도록 하는 것입니다. 기판 및 테스트 화합물을 준비하려면 4개의 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 각각 12개의 미세리터를 추가하고 0분 제어 및 30분 제어 튜브에 6개의 미정 DMSO를 추가합니다.시험 화합물의 6마이크로리터를 제1 실험 튜브에 추가하고 시험 화합물의 3개의 마이크로리터와 중음DMSO3마이크로리터를 제2 실험 튜브에 첨가한다. 다음으로, 300 마이크로리터의 중수소 산화물을 반응 버퍼 2.59밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가하고, 그 다음으로 25마이크로리터의 효소 용액을 함유하고 있습니다. 튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고 1.5 개의 어금니 염산 10 마이크로 리터를 반응 스톡 솔루션 582 마이크로 리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 추가하십시오.그런 다음, 반응 스톡 용액및 산의 전체 부피를 제로분 제어 튜브로 동시에 전송하여 제로분 제어 반응을 동시에 개시하고 담금질한다. 느리지만 의도적인 방식으로 샘플을 두 번 흡입하고 분배합니다. 나머지 3개의 반응을 비틀거리는 방식으로 시작하고 실행하여 반응 스톡 솔루션 582마이크로리터를 첫 번째 실험 튜브로 즉시 전송하고 방금 입증된 대로 샘플을 두 번 혼합합니다.신중한 포부와 디스펜싱은 개시 단계 동안 완전한 혼합을 보장합니다. 차동 혼합이 변수가 아닌지 확인하기 위해 각 샘플과 일치하십시오. 30초 후, 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 제2 실험관 및 혼합으로 옮기고, 제2 실험관에서 반응을 시작하고 30분 제어관에 반응 스톡 용액 582마이크로리터를 첨가하였다.30분 후, 첫 번째 실험 관에 1.5-어금다 염산 10 마이크로리터를 추가하여 제2 실험 및 30분 제어 튜브에 대해 30초 간격으로 담금질을 반복합니다. 모든 반응이 담금질되면 각 반응에서 NMR 튜브로 600 마이크로리터의 용액을 전달합니다. 컨트롤 스펙트럼에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하려면 샘플을 분광계에 로드하고 NMR 스펙트럼을 수집하며 0 및 30분 컨트롤에 대한 스펙트럼을 오버레이합니다.기판 신호를 0분 제어에서 배율 조정하여 30분 제어에 일치하고 이 백분율을 기록합니다. 그런 다음 백분율 변환을 기판 신호일치에서 백분율을 뺀 백분율을 계산합니다. 시험 화합물을 포함하는 반응에 대한 기판의 백분율 변환을 계산하기 위해, 500 마이크로몰러 테스트 화합물을 포함하는 제로 분 제어 및 첫 번째 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고 시험 화합물과 스펙트럼과 스펙트럼을 일치시키기 위해 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다.이 백분율을 기록하고 방금 설명한 대로 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다. 이어서, 250 마이크로몰러 시험 화합물을 포함하는 제로분 제어 및 제1 반응에 대한 스펙트럼을 오버레이하고, 시험 화합물과 스펙트럼에 맞게 제로 분 제어에서 기판 신호를 배율한다. 백분율을 기록한 후 백분율 변환을 계산하는 데 사용합니다.각 시험 화합물 농도에 대한 백분율 반응 및 백분율 억제를 계산하기 위해 먼저, 대조군 시간의 백분율 변환으로 나누어 시험 화합물의 백분율 변환으로서 백분율 반응을 계산한다 100. 그런 다음 백분율 억제를 100으로 계산하여 백분율 반응을 뺀 값입니다. 세제 카운터 스크린 분석법을 수행하려면 300 마이크로리터의 산화황과 25마이크로리터의 효소 용액을 반응 완충제 2.59 밀리리터를 함유한 15밀리리터 튜브에 추가합니다.튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 용액을 혼합하고, 트리톤 X-100 세제의 마이크로리터 2개를 반응 버퍼 20밀리리터에 추가합니다. 그런 다음 0.01%트리톤 X-100 세제를 함유한 반응 버퍼 2.59밀리리터를 새로운 15밀리리터 원내 튜브에 첨가합니다. 그런 다음 300 마이크로리터의 산화철과 25마이크로리터의 효소 용액을 튜브에 첨가합니다.튜브를 두 번 부드럽게 반전하여 반응 스톡 솔루션을 혼합합니다. 그런 다음, 100 마이크로몰라 및 50 마이크로몰러 테스트 화합물에 대한 백분율 억제를 방금 입증한 바와 같이 결정한다. 세제 없이 반응 스톡 솔루션을 사용 하 여, 4개의 튜브의 1 세트 및 4개의 튜브의 두 번째 세트에 대 한 세제와 반응 스톡 솔루션.점프 희석을 수행하기 위해 반응 완충제 468마이크로리터와 산화황 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액 5개, 30분 동안 배양한 DMSO 1.2 마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송한다. 혼합물을 두 번 흡입하고 분배하면서 느리지만 의도적인 방식으로 분배합니다. 반응 완충제 468마이크로리터와 산화중수소 60마이크로리터를 53.8 마이크로리터의 반응 완충제, 5마이크로리터의 효소 용액, 30분 동안 배양한 1.2마이크로리터를 포함하는 튜브로 이송하기 전에.두 번째 반응을 두 번 혼합합니다. 그리고 즉시 588 마이크로리터의 용액을 점프 희석 DMSO 제어 튜브에서 혼합과 함께 12 마이크로리터의 기판을 포함하는 튜브로 이송한다. 점프 희석 시험 화합물 튜브, 희석되지 않은 DMSO 제어 튜브 및 희석되지 않은 테스트 화합물 튜브에서 588 마이크로리터를 30초 간격으로 혼합하여 튜브당 기판 12마이크로리터를 각각 3개의 1.5밀리리터 튜브로 계속 이송합니다.그런 다음 반응을 담금질하고 NMR 스펙트럼을 수집하고 각 화합물에 대한 백분율 억제를 계산하기 전에 30 분 동안 기다립니다. 여기서 입증된 바와 같이 양성자 NMR을 이용한 초기 시험 화합물 분석에서 AgNH에 대한 2개의 화합물을 테스트한 결과가 나타난다. 효소 반응은 아데노신 싱글의 실종에 의해 가장 쉽게 관찰되고 정량화되며 각각 8.48 및 6.09 부품에서 이중 공명.그리고 30 분 제어 스펙트럼에서 관찰된 바와 같이 백만 당 8.33 부품에서 아데닌 싱글 레지던스의 출현. 이 그림에서, 양성자 NMR을 이용한 세제 카운터스크린 분석에서 AgNH에 대한 2개의 농도에서 화합물을 시험한 결과가 입증된 바와 같이 나타났다. 기판및 제품 신호의 강도에서 관찰된 효소 억제는 화합물 응집의 아티팩트가 아니라는 것을 나타내는 최소한의 차이만이 관찰된다.시험된 화합물및 세제에서 발생하는 공명은 기판 또는 제품 공명을 방해하지 않는다는 점에 유의하십시오. 양성자 NMR을 이용한 AGNH에 대한 점프 희석 분석에서 화합물을 테스트한 결과, 200마이크로몰라 반응에 비해 20마이크로몰라 반응에서 기판 신호의 강도가 감소되어 억제가 가역적임을 나타낸다. 각 반응을 개시하는 동안 및 점프 희석에 대한 완전한 샘플 혼합이 중요합니다.신중하고 일관된 포부와 분배가 필요합니다. NMR 기반 의 소법은 또한 반응 완충제 및 효소 대신 에 중단된 세포를 포함하는 용액을 사용하여 전체 세포에서 효소 활성을 측정하는 데 사용될 수 있다. 우리의 항 trichomonal 약물 발견 노력은 리보 하이드로 라제 효소에 대한 새로 합성 된 화합물의 효능을 측정하기 위해 이러한 검사에 계속 의존하고 있습니다.비록 그것은 매우 소량에서 사용, 반응을 담금질 하는 데 사용 되는 염산은 위험 하 고 적절 한 개인 보호 장비와 함께 사용 해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

연구

화학

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

형광 기반 얼음 비행기 선호도에 의해 부동액 단백질의 얼음 결합 평면 결정

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

프로 형광 기판 아날로그를 통해 PAD4 활동의 형광 기반의 모니터링

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

탈 아세틸 화 분석법은 시르 투 인 사이의 상호 작용 (SIRT2) 및 특정 단백질 기판을 해명

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

특성, 벤젠 폴리 카르 복실 산을 사용하여 발열 성 탄소의 정량 및 화합물 특정 동위 원소 분석 (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC 기반 분석은 인간의 만성 림프 구성 백혈병 세포에 세포 외 뉴클레오티드 / 뉴 클레오 시드 신진 대사를 모니터링하기

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

보장<em&gt; N</em&gt; - 헤테로 사이 클릭 카벤 착물 : 벤즈 이미 다 졸리움 염으로부터의 합성 및 탄소 - 탄소 결합 형성 반응에서의 촉매 활성

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...