Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Vi takker Dr. Dean Brown for å gi forbindelser fra AstraZeneca fragment biblioteket og Dr. David Parkin for å gi AGNH og UNH enzymer. Forskning som rapporteres i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of allergi og smittsomme sykdommer i National Institutes of Health under Award Number R15AI128585 til B. J. S. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Research ble også støttet av en Horace G. McDonell Summer Research Fellowship tildelt S. N. M., en Landesberg familie Fellowship tildelt J. G., og fakultet utviklings stipend og Frederick Bettelheim Research Award fra Adelphi University til JP S.

1. innledende test sammensatte analyser ved 500 μM og 250 μM
<ol><li>Forbered substrat og test sammensatte for reaksjoner.<ol>
<li>Forbered lager løsninger av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) i vann og 50 mM test sammensatte i deuterert dimethyl sulfoxide (DMSO). Se Introduksjons seksjonen for konsentrasjoner av substrat løsning å bruke.</li>
		<li>Tilsett 12 μL av substrat (adenosin eller 5-fluorouridine) til hver av de fire 1,5 mL microfuge rørene, 1 – 4.</li>
		<li>Tilsett 6 μL av deuterert DMSO t...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Protokollene beskrevet er generelt gjelder for mange enzymer, forutsatt at underlag og/eller produkter har kan løses signaler i NMR spektrum. Det er imidlertid avgjørende at konsentrasjonen av underlaget er nær sin Km verdi og høy nok til å bli oppdaget i et NMR eksperiment innen rimelig tidsramme. Et substrat konsentrasjon ikke høyere enn 2-3x Km -verdien er optimal for påvisning av konkurrerende, nonkompetitiv og utkonkurrert hemmere4. Som vist her ...

Kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er godt etablert for karakteriserer og overvåking enzymreaksjoner1,2. Forskjeller i kjemiske Skift og koblings mønstre brukes til å skille substrat og produkt resonanser, og relativ resonans intensitet brukes til å kvantifisere prosent av reaksjonen. Både forbruk av substrat og etablering av produktet er direkte observert i NMR spektrum. Dette kontraster med Spektrofotometri eller fluorescens spektroskopi, der reaksjonstiden kurset er indikert av en endring i absorbansen tilskrives noen kjemiske arter blir konsumert eller opprettet. Akkurat som med de andre metodene, kan NMR brukes til å studere enzymreaksjoner som en funksjon av temperatur, pH, eller andre løsnings betingelser, og effekten av hemmere kan bestemmes.
Mer nylig har NMR-baserte enzym aktivitet analyser blitt demonstrert for fragment screening3,4. NMR-baserte analyser er ideelt egnet til å arbeide ved høyere konsentrasjoner av test forbindelser (ofte så høyt som 1 mM) som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i NMR eksperimentet kan enkelt løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette sammenligner gunstig til Spektrofotometriske analyser der lese forstyrrelser problemer ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjon profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Denne fordelen gjør dem nyttige som ortogonale analyser, supplerer tradisjonell høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser5.
I vårt forskningslaboratorium brukes NMR-baserte aktivitets analyser til å identifisere og evaluere hemmere av trichomonas vaginalis nukleosid ribohydrolases. T. vaginalis parasitten forårsaker de mest utbredte ikke-viral seksuelt overførbare sykdommer6. Økende motstand mot eksisterende terapier7 kjører behovet for romanen, mekanisme-baserte behandlinger, med essensielle nukleosid berging Pathway enzymer som representerer Prime mål8. NMR-baserte aktivitet analyser er utviklet for både pyrimidin-og purine-spesifikke enzymer, uridindifosfatglukuronosyltransferase nukleosid ribohydrolase (UNH)9, og adenosin/guanosin foretrakk nukleosid RIBOHYDROLASE (AGNH)10. Reaksjonene som katalysert av disse to enzymene er vist i figur 1. NMR-analysene brukes til å skjerm fragment biblioteker for kjemiske startpunkter, bestemme IC50 -verdier og Luke ut aggregering-baserte eller kovalente binding hemmere11. De samme analysene blir også oversatt for å vurdere enzym aktivitet i hele celler12.
Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Protokollene er generelt gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. Tre forutsetninger har blitt gjort for enkelhet. Først er underlaget ikke spesifisert. For at NMR-baserte aktivitets analyser skal være nyttige, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x Km verdi4. I eksemplene som vises, er de endelige konsentrasjonene av adenosin og 5-fluorouridine 100 μM (km = 54 μM) og 50 μm (km = 15 μM), henholdsvis. I protokollene, som oppnår disse konsentrasjonene tilsvarer 12 μL av 5 mM adenosin eller 12 μL av 2,5 mM 5-fluorouridine.
For det andre, mengden av enzymet fastsatt i protokollene, 5 μL, ble valgt til å tilsvare det beløpet som kreves for å resultere i ca 75% konvertering av substrat til produktet i 30 min. Dette antallet representerer vanligvis en stor fortynning fra et renset enzym lager, og fortynning må fastsettes på forhånd for hvert enzym. Renset AGNH og UNH enzym lager løsninger er lagret ved-80 ° c i alikvoter som gir nok enzym for flere tusen reaksjoner. Således, det fortynning faktoren ideal bare nødvendig å bli besluttet eller godkjent enhver få måneder. For det tredje er ikke det spesifikke 1D NMR-eksperimentet angitt. I de representative resultatene vises 1H NMR for AGNH10 og 19F NMR vises for UNH9, med det NMR eksperimentet som er beskrevet i de tilsvarende referansene. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering. Til slutt bør det være påpekt at den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet ikke overholder de strenge kravene til kvantitative NMR (qNMR)13,14. I protokollen bestemmes en prosent reaksjon ved hjelp av de relative endringene i intensiteten av den samme resonans i hvert spektrum, i stedet for ved å bestemme absolutte konsentrasjoner. Denne tilnærmingen eliminerer behovet for innhenting av data og behandling av modifikasjoner i tillegg til interne eller eksterne standarder, som kreves for qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR spektroskopi brukes ofte for identifisering og karakterisering av enzym hemmere i stoffet funnet, spesielt i sammenheng med fragment screening. NMR-baserte aktivitet analysene er ideelt egnet til å arbeide på høyere konsentrasjoner av test forbindelser som kreves for å oppdage disse svakere hemmere. Den dynamiske rekkevidden og kjemisk forskyvning dispersjon i et NMR eksperiment kan lett løse resonanser fra substrat, produkt, og test forbindelser. Dette står i kontrast til Spektrofotometriske analyser, der problemer med lese forstyrrelser ofte oppstår fra forbindelser med overlappende UV-Vis absorpsjons profiler. I tillegg, siden de mangler reporter enzymer, enkelt-enzym NMR analysene er ikke utsatt for koblet-analysen falske positiver. Dette attributtet gjør dem nyttige som ortogonale analyser, og supplerer tradisjonelle høy gjennomstrømming screening analyser og stasjonære sortering analyser. Detaljerte protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for å bestemme IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler. Metodene er demonstrert ved hjelp av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Bruken av 1H NMR er vist for det purine-spesifikke enzymet, mens 19F NMR er vist for det pyrimidin-spesifikke enzymet. Protokollene er vanligvis gjelder for alle enzym der substrat og produkt resonanser kan observeres og skilles av NMR spektroskopi. For å være den mest nyttige i sammenheng med stoffet funnet, bør den endelige konsentrasjonen av underlaget ikke være mer enn 2-3x sin Km verdi. Valget av NMR eksperiment avhenger av enzymet reaksjon og underlag tilgjengelig samt tilgjengelig NMR instrumentering.

Figur 2 viser resultatene for testing av to FORBINDELSER mot AGNH med 1H NMR etter avsnitt 1. Enzymet reaksjonen er lettest observert og kvantifisert av forsvinningen av adenosin singlet og doublet resonanser ved 8,48 ppm og 6,09 ppm, henholdsvis, og utseendet av en adenine singlet resonans på 8,33 ppm som observert i 30 min kontroll Spekteret. I nærvær av 500 μM sammensatte 1, er ingen produkt dannet som dokumentert av mangelen på en adenine resonans på 8,33 ppm. I nærvær...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-baserte aktivitet analyser for å bestemme sammensatte hemming, IC50 verdier, Artifactual aktivitet, og hele cellen aktivitet av nukleosid Ribohydrolases

NMR-baserte aktivitets analyser er utviklet for å identifisere og karakterisere hemmere av to nukleosid ribohydrolase enzymer. Protokoller er gitt for innledende sammensatte analyser på 500 μM og 250 μM, dose-respons analyser for fastsettelse av IC50 verdier, vaskemiddel Counter skjerm analyser, Jump-fortynning Counter skjerm analyser, og analyser i E. coli hele celler.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR-baserte aktivitetsanalyser gir en effektiv metode for å identifisere, evaluere og validere hemmere for et gitt enzym. De er spesielt godt egnet for fragmentscreening. NMR-analyser er mottagelige for de høyere sammensatte konsentrasjonene som kreves for svakere hemmere.I tillegg gjør mangelen på reporterenzymer dem mindre utsatt for falske positive. Vi bruker NMR-analysene i laboratoriet vårt til å identifisere og karakterisere hemmere av to enzymer fra Trichomonas vaginalis. Begge enzymene representerer nye mål for nye anti-trikomonale legemidler.NMR-analysene gjelder generelt for ethvert forskningsområde som involverer enzymer, og de kan til og med brukes til å studere enzymene inne i cellene. De viktigste aspektene ved teknikken er å sikre at de riktige reagensvolumene er pipettert og reaksjonskomponentene blandes grundig. For å forberede underlaget og testforbindelser, legg til 12 mikroliter substrat til hver av fire 1,5-milliliter mikrofuge rør og legg til seks mikroliter av deuterated DMSO til null-minutters kontroll og 30-minutters kontrollrør.Tilsett seks mikroliter av testforbindelsen til det første eksperimentelle røret og tre mikroliter av testforbindelsen og tre mikroliter av deuterated DMSO til det andre eksperimentelle røret. Deretter legger du til 300 mikroliter deuteriumoksid til et 15-milliliter rør som inneholder 2,59 milliliter reaksjonsbuffer, etterfulgt av 25 mikroliter enzymoppløsning. Snu forsiktig røret to ganger for å blande reaksjonslagerløsning og tilsett 10 mikroliter med 1,5 molarsyklorsyre til et 1,5-milliliter rør som inneholder 582 mikroliter reaksjonslagerløsning.Deretter overfører du hele volumet av reaksjonslagerløsning og syre til det null-minutters kontrollrøret for samtidig å starte og slukke nullminuttskontrollreaksjonen. Aspirere og dispensere prøven to ganger på en langsom, men bevisst måte. Initier og kjør de resterende tre reaksjonene på forskjøvet måte, og umiddelbart overføre 582 mikroliter av reaksjonslagerløsningen til det første eksperimentelle røret og blande prøven to ganger som nettopp demonstrert.En forsiktig aspirasjon og dispensering sikrer en fullstendig blanding under initieringstrinnene. Vær i samsvar med hver prøve for å sikre differensialblanding ikke er en variabel. Etter 30 sekunder overfører du 582 mikroliter reaksjonslagerløsning til det andre eksperimentelle røret og blandingen, etterfulgt av tilsetning av ytterligere 582 mikroliter reaksjonslagerløsning til det 30-minutters kontrollrøret 30 sekunder etter å ha startet reaksjonen i det andre eksperimentelle røret.Etter 30 minutter legger du til 10 mikroliter 1,5-molarhydroklorsyre til det første eksperimentelle røret, og gjentar slukkingen med 30-sekunders intervaller for de andre eksperimentelle og 30-minutters kontrollrørene. Når alle reaksjonene er slukket, overfører du 600 mikroliter oppløsning fra hver reaksjon på NMR-rør. Hvis du vil beregne prosentvis konvertering av substrat for kontrollspektraet, laster du prøvene på spektrometeret, samler inn NMR-spektraet og legger spektraet over spektraet for kontrollene på null og 30 minutter.Skaler underlagets signal i nullminuttskontrollen slik at det samsvarer med 30-minutters kontrollen, og noter denne prosentandelen. Deretter beregner du prosentkonverteringen som 100 minus prosentandelen fra samsvar av underlagets signaler. For å beregne prosentvis konvertering av substratet for reaksjonene som inneholder testforbindelsen, overlegg spektra for null-minutters kontroll og den første reaksjonen som inneholder 500-mikromolartestforbindelsen og skalerer substratsignalet i null-minutters kontrollen for å matche spekteret med testforbindelsen.Legg merke til denne prosentandelen, og bruk den til å beregne prosentkonverteringen som nettopp demonstrert. Deretter legger du over spektraet for null-minutters kontroll og den første reaksjonen som inneholder 250-mikromolartestforbindelsen, og skalerer substratsignalet i null-minutters kontrollen for å matche spekteret med testforbindelsen. Når du har notert prosentandelen, bruker du den til å beregne prosentkonverteringen.For å beregne prosentreaksjonen og prosenthemmingen for hver testsammensatte konsentrasjon, må du først beregne prosentreaksjonen som prosentvis konvertering av testforbindelsen, delt på prosentkonverteringen av kontrolltidene 100. Beregn deretter prosenthemmingen som 100 minus prosentreaksjonen. For å utføre en vaskemiddeltelleranalyse, tilsett 300 mikroliter deuteriumoksid og 25 mikroliter enzymløsning til et 15-milliliter rør som inneholder 2,59 milliliter reaksjonsbuffer.Snu forsiktig røret to ganger for å blande reaksjonslagerløsningen, og tilsett to mikroliter av Triton X-100 vaskemiddel til 20 milliliter reaksjonsbuffer. Deretter legger du til 2,59 milliliter reaksjonsbuffer, som inneholder 0,01% Triton X-100 vaskemiddel til et nytt konisk rør på 15 milliliter. Tilsett deretter 300 mikroliter deuteriumoksid og 25 mikroliter enzymløsning til røret.Snu forsiktig røret to ganger for å blande reaksjonslagerløsning. Deretter bestemmer du prosenthemmingen for 100-mikromos og 50 mikromolar testforbindelser som nettopp demonstrert. Bruk av reaksjonslagerløsningen uten vaskemiddel, for ett sett med fire rør og reaksjonslagerløsningen med vaskemiddel for et andre sett med fire rør.For å utføre en jump-fortynning, overføre 468 mikroliter reaksjonsbuffer og 60 mikroliter deuteriumoksid til et rør som inneholder 53,8 mikroliter reaksjonsbuffer, fem mikroliter av enzymløsning og 1,2 mikroliter DMSO som har ruget i 30 minutter. Aspirer og dispenser blandingen to ganger på en langsom, men bevisst måte. Før overføring av 468 mikroliter reaksjonsbuffer og 60 mikroliter deuteriumoksid til et rør som inneholder 53,8 mikroliter reaksjonsbuffer, fem mikroliter enzymoppløsning og 1,2 mikroliter av testforbindelse som har ruget i 30 minutter.Bland den andre reaksjonen to ganger som vist. Og overfør umiddelbart 588 mikroliter oppløsning fra hoppefortynning DMSO kontrollrør til et rør som inneholder 12 mikroliter substrat med blanding. Fortsett å overføre 588 mikroliter fra hoppefortynningstestrøret, det ufortynnede DMSO-kontrollrøret og det ufortynnede testanlegget til hver av tre 1,5-milliliter rør, som inneholder 12 mikroliter substrat per rør med blanding med 30-sekunders intervaller deretter.Vent deretter 30 minutter før du slukker reaksjonene, samler NMR-spektra, og beregner prosenthemmingen for hver forbindelse som nettopp demonstrert. Her resultatene for testing to forbindelser mot AgNH i en innledende test sammensatt analyse ved hjelp av proton NMR som demonstrert er vist. Enzymet reaksjon er lettst observert og kvantifisert ved forsvinningen av adenosin singlet og doble resonanser på 8,48 og 6,09 deler per million henholdsvis.Og utseendet på en adenin singlet bolig på 8,33 deler per million som observert i 30-minutters kontrollspekteret. I dette tallet vises resultatene for å teste en forbindelse ved to konsentrasjoner mot AgNH i en rengjøringsmiddelkontringsanalyse ved hjelp av proton-NMR som vist. Bare minimale forskjeller observeres i intensitetene i substratet og produktsignaler ved hjelp av de to forholdene, noe som indikerer at den observerte enzymhemmingen ikke er en artefakt av sammensatt aggregering.Vær oppmerksom på at resonanser som oppstår fra den testede forbindelsen og vaskemiddelet ikke forstyrrer substratet eller produktresonansene. Resultatene for å teste en forbindelse i en jump-fortynningsanalyse mot AGNH ved hjelp av proton NMR som vist viser en redusert intensitet av substratsignalet i 20-mikromolarreaksjonen sammenlignet med 200-mikromolarreaksjonen, noe som indikerer at hemmingen er reversibel. En komplett prøveblanding under initiering av hver reaksjon og for hoppfortynningene er kritisk.En forsiktig og konsekvent aspirasjon og dispensering er nødvendig. NMR-baserte analyser kan også brukes til å måle enzymaktiviteten i hele celler, ved hjelp av en løsning som inneholder suspenderte celler i stedet for reaksjonsbufferen og enzymet. Vår anti-trichomonal narkotika oppdagelse innsats fortsetter å stole på disse analysene for å måle styrken av nylig syntetiserte forbindelser mot ribohydrolase enzymer.Selv om den brukes i bare svært små mengder, er saltsyren som brukes til å slukke reaksjonene farlige og bør brukes med riktig personlig verneutstyr.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state, Pre-steady-state, og Single-omsetningen Kinetic måling for DNA glykosylase aktivitet

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestemme isbindende fly av frostvæskeproteiner ved fluorescensbasert isplanaffinitet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nukleosidtrifosfater - Fra Synthesis til Biokjemisk karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescens-basert overvåking av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

En kolorimetrisk analyse som spesifikt Måler granzyme B Proteolytisk aktivitet: Hydrolyse av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser å greie samspillet mellom sirtuins (SIRT2) og spesifikt protein-substrater

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, Kvantifisering og Compound-spesifikke Isotop Analyse av Pyrogen Carbon Bruke Benzen polykarboksylsyrer (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-basert analyse for å overvåke ekstracellulær nukleotid / Nukleosid- Metabolisme i Human kronisk lymfatisk leukemi celler

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

palladium<em&gt; N</em&gt; -Heterocykliske karbenkomplekser: Syntese fra benzimidazoliumsalter og katalytisk aktivitet i karbon-karbon-bindingsdannende reaksjoner

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Samtidig måling av HDAC1 og HDAC6 aktivitet i HeLa celler ved hjelp av UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...