Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Agradecemos ao Dr. Dean Brown por fornecer compostos da biblioteca de fragmentos AstraZeneca e do Dr. David Parkin para fornecer as enzimas AGNH e UNH. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas dos institutos nacionais de saúde o prêmio número R15AI128585 a B. J. S. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais dos institutos nacionais de saúde. a Research também foi apoiada por um Horace G. McDonell Summer Research Fellowship concedida a S. N. M., uma família Landesberg Bolsa concedida a J. A. G., e bolsas de desenvolvimento do corpo docente e prêmio de pesquisa Frederick Bettelheim da Universidade Adelphi para B. J. S.

1. ensaios de compostos de teste inicial a 500 μM e 250 μM
<ol><li>Prepare substrato e teste composto para reações.<ol>
<li>Prepare soluções de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) em água e composto de teste de 50 mM em dimetil sulfóxido (DMSO) deuterado. Consulte a secção de introdução para concentrações de solução de substrato a utilizar.</li>
		<li>Adicionar 12 μL de substrato (adenosina ou 5-fluorouridina) a cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, 1 – 4.</li>
		<li>Adicionar ...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Os protocolos descritos são geralmente aplicáveis a muitas enzimas, desde que os substratos e/ou produtos tenham sinais resolvíveis no espectro de RMN. No entanto, é crítico que a concentração de substrato está perto de seu valor de Km e alta o suficiente para ser detectado em um experimento de RMN dentro de um prazo razoável. Uma concentração de substrato não superior a 2-3x o valor de Km é ideal para detectar inibidores competitivos, não competitivos e não competit...

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) é bem estabelecida para caracterizar e monitorar as reações enzimáticas1,2. As diferenças nos deslocamentos químicos e nos padrões de acoplamento são usadas para distinguir as ressonâncias do substrato e do produto, e as intensidades de ressonância relativas são usadas para quantificar o percentual de reação. Tanto o consumo de substrato quanto a criação do produto são observados diretamente no espectro de RMN. Isso contrasta com a espectrofotometria ou espectroscopia de fluorescência, na qual o curso de tempo de reação é indicado por uma alteração na absorvência atribuível a algumas espécies químicas que estão sendo consumidas ou criadas. Assim como com os outros métodos, RMN pode ser usado para estudar as reações enzimáticas em função da temperatura, pH, ou outras condições da solução, e os efeitos dos inibidores podem ser determinados.
Mais recentemente, foram demonstrados os ensaios de atividade enzimática baseada em RMN para a triagem de fragmentos3,4. Os ensaios baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de ensaio (frequentemente tão elevados como 1 mM) necessários para detectar estes inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento na experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isto compara favoràvel aos ensaios espectrofotométricos onde os problemas da interferência da leitura-para fora levantam-se frequentemente dos compostos com perfis de absorção UV-VIS de sobreposição. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Essa vantagem os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta produtividade e os ensaios de triagens de bancada5.
Em nosso laboratório de pesquisa, os ensaios de atividade baseados em RMN são usados para identificar e avaliar os inibidores de Trichomonas vaginalis nucleosídeo ribohydrolases. O parasita T. vaginalis causa a doença sexualmente transmissível não viral mais prevalente6. Aumentar a resistência às terapias existentes7 está conduzindo a necessidade para tratamentos novos, mecanismo-baseados, com as enzimas essenciais do caminho do salvamento do nucleosídeo que representam alvos principais8. Foram desenvolvidos ensaios de atividade baseados em RMN para as enzimas pirimidina e Purina específicas, a ribohydrolase do nucleosídeo uridina (UNH)9e a adenosina/guanosina preferindo a ribohidlase nucleosídeo (agnh)10. As reações catalisadas por estas duas enzimas são mostradas na Figura 1. Os ensaios de RMN estão sendo usados para fazer a tela de bibliotecas de fragmentos para pontos de partida químicos, determinar os valores de IC50 e eliminar inibidores de ligação com base em agregação ou covalentes11. Os mesmos ensaios também estão sendo traduzidos para avaliar a atividade enzimática em células inteiras12.
Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima em que as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas pela espectroscopia de RMN. Três suposições foram feitas para a simplicidade. Primeiro, o substrato não é especificado. Para que os ensaios de atividade baseados em RMN sejam úteis, a concentração final do substrato deve ser não superior a 2-3x o valor de Km 4. Nos exemplos mostrados, as concentrações finais de adenosina e 5-fluorouridina são 100 μM (km = 54 μM) e 50 μm (km = 15 μm), respectivamente. Nos protocolos, atingir estas concentrações corresponde a 12 μL de 5 mM de adenosina ou 12 μL de 2,5 mM 5-fluorouridina.
Em segundo lugar, a quantidade de enzima prevista nos protocolos, 5 μL, foi escolhida para corresponder à quantidade necessária para resultar em aproximadamente 75% de conversão do substrato para o produto em 30 min. Esta quantidade representa tipicamente uma grande diluição de um estoque purified da enzima, e a diluição deve ser determinada adiantado para cada enzima. As soluções de estoque de enzimas purificadas AGNH e UNH são armazenadas em-80 ° c em alíquotas que fornecem enzima suficiente para várias milhares de reações. Assim, o fator de diluição idealmente só precisa ser determinado ou validado a cada poucos meses. Em terceiro lugar, o experimento NMR 1D específico não é especificado. Nos resultados representativos, 1H NMR é mostrado para agnh10 e 19F NMR é mostrado para unh9, com o experimento de RMN descrito nas referências correspondentes. A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível. Por fim, deve-se salientar que a abordagem experimental descrita não adere às rigorosas exigências da RMN quantitativa (qnmr)13,14. No protocolo, uma reação percentual é determinada usando as alterações relativas na intensidade da mesma ressonância em cada espectro, em vez de determinar concentrações absolutas. Essa abordagem elimina a necessidade de aquisição de dados e modificações de processamento, bem como padrões internos ou externos, que são necessários para qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

A espectroscopia de RMN é freqüentemente utilizada para a identificação e caracterização de inibidores enzimáticos na descoberta de fármacos, particularmente no contexto de triagem de fragmentos. Os ensaios de atividade baseados em RMN são ideais para trabalhar nas concentrações mais elevadas de compostos de teste necessários para detectar esses inibidores mais fracos. A escala dinâmica e a dispersão química do deslocamento em uma experimentação de RMN podem facilmente resolver ressonâncias do substrato, do produto, e dos compostos do teste. Isso contrasta com os ensaios espectrofotométricos, nos quais os problemas de interferência de leitura geralmente surgem de compostos com perfis de absorção UV-VIS sobrepostos. Além, desde que faltam enzimas do repórter, os ensaios da RMN da único-enzima não são propensas aos falsos positivos acoplados-ensaio. Este atributo os torna úteis como ensaios ortogonais, complementando os ensaios tradicionais de triagem de alta taxa de transferência e ensaios de triagem de bancada. Os protocolos detalhados são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli . Os métodos são demonstrados usando duas enzimas do ribohydrolase do nucleosídeo. O uso de 1H NMR é mostrado para a enzima purine-específica, quando 19F NMR for mostrado para a enzima pyrimidine-específica. Os protocolos são geralmente aplicáveis a qualquer enzima onde as ressonâncias de substrato e produto podem ser observadas e distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser o mais útil no contexto da descoberta de drogas, a concentração final de substrato deve ser não mais do que 2-3x seu valor de Km . A escolha do experimento de RMN depende da reação enzimática e dos substratos disponíveis, bem como da instrumentação de RMN disponível.

A Figura 2 mostra os resultados para testar dois compostos contra agnh usando 1H NMR após a seção 1. A reação enzimática é mais facilmente observada e quantificada pelo desaparecimento do singlet de adenosina e ressonâncias de gibão em 8,48 ppm e 6, 9 ppm, respectivamente, e o aparecimento de uma ressonância singela de adenina a 8,33 ppm, como observado no controle de 30 min Espectro. Na presença de 500 μM composto 1, nenhum produto é formado como evidenciado pela fal...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Ensaios de atividade com base em RMN para determinação da inibição de compostos, valores de IC50 , atividade Artifactual e atividade de células inteiras de Ribohidrolases nucleósidos

Foram desenvolvidos ensaios de atividade com base em RMN para identificar e caracterizar inibidores de duas enzimas de riboidrolase nucleósidas. Os protocolos são fornecidos para ensaios compostos iniciais em 500 μM e 250 μM, ensaios de dose-resposta para a determinação de valores de IC50 , ensaios de tela de contador de detergente, ensaios de tela de contador de diluição de salto e ensaios em células inteiras de e. coli .

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Os ensaios de atividade baseados em NMR fornecem um método eficaz para identificar, avaliar e validar inibidores para uma determinada enzima. Eles são particularmente adequados para a triagem de fragmentos. Os ensaios de RN são favoráveis às concentrações compostas mais elevadas necessárias para inibidores mais fracos.Além disso, a falta de enzimas de repórteres as torna menos propensas a falsos positivos. Usamos os ensaios de RMN em nosso laboratório para identificar e caracterizar os inibidores de duas enzimas de Trichomonas vaginalis. Ambas as enzimas representam novos alvos para novas drogas anti-tricolmonais.Os ensaios de RN são geralmente aplicáveis a qualquer área de pesquisa que envolva enzimas, e eles podem até mesmo ser usados para estudar as enzimas dentro das células. Os aspectos mais importantes da técnica são garantir que os volumes corretos de reagente sejam pipetos e os componentes de reação sejam completamente misturados. Para preparar os compostos de substrato e teste, adicione 12 microlitadores de substrato a cada um dos quatro tubos de microfuge de 1,5 mililitro e adicione seis microliters de DMSO deuterados ao controle de zero-minuto e tubos de controle de 30 minutos.Adicione seis microliters do composto de teste ao primeiro tubo experimental e três microliters do composto de teste e três microliters de DMSO deuterados ao segundo tubo experimental. Em seguida, adicione 300 microliters de óxido de deutério a um tubo de 15 mililitros contendo 2,59 mililitros de tampão de reação, seguido por 25 microliters de solução enzimática. Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação e adicione 10 microliters de ácido clorídrico molar de 1,5 milaturro a um tubo de 1,5 mililitro contendo 582 microliters de solução de estoque de reação.Em seguida, transfira todo o volume de solução de estoque de reação e ácido para o tubo de controle de zero-minuto para iniciar simultaneamente e saciar a reação de controle de zero minuto. Aspirar e dispensar a amostra duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Inicie e execute as três reações restantes de forma escalonada, transferindo imediatamente 582 microliters da solução de estoque de reação para o primeiro tubo experimental e misturando a amostra duas vezes como apenas demonstrado.Uma aspiração cuidadosa e dispensação garante uma mistura completa durante as etapas de iniciação. Seja consistente com cada amostra para garantir que a mistura diferencial não seja uma variável. Após 30 segundos, transfira 582 microliters de solução de estoque de reação para o segundo tubo experimental e mix, seguido pela adição de outros 582 microliters de solução de estoque de reação para o tubo de controle de 30 minutos 30 segundos após iniciar a reação no segundo tubo experimental.Após 30 minutos, adicione 10 microlitadores de ácido clorídrico de 1,5 molar ao primeiro tubo experimental, repetindo a saciedação em intervalos de 30 segundos para os tubos de controle experimentais e de 30 minutos. Quando todas as reações tiverem sido suprimidas, transfira 600 microliters de solução de cada reação para tubos NMR. Para calcular a conversão percentual de substrato para o espectro de controle, carregue as amostras no espectrômetro, colete o espectro NMR e sobreponha os espectros para os controles zero e 30 minutos.Dimensione o sinal do substrato no controle de zero minutos para corresponder ao controle de 30 minutos e observe essa porcentagem. Em seguida, calcule a conversão percentual como 100 menos a porcentagem da correspondência dos sinais do substrato. Para calcular a conversão percentual do substrato para as reações contendo o composto de teste, sobreponha o espectro para o controle de zero-minuto e a primeira reação contendo o composto de teste de 500 micromolares e dimensione o sinal do substrato no controle de zero minuto para combinar o espectro com o composto de teste.Observe esta porcentagem e use-a para calcular a conversão percentual como apenas demonstrado. Em seguida, sobreponha o espectro para o controle de zero-minuto e a primeira reação contendo o composto de teste de 250 micromolar, e dimensione o sinal do substrato no controle de zero-minuto para combinar o espectro com o composto de teste. Depois de notar a porcentagem, use-a para calcular a conversão percentual.Para calcular a reação percentual e a inibição percentual para cada concentração composta de teste, primeiro, calcule a reação percentual como a conversão percentual do composto de teste, dividida pela conversão percentual do controle vezes 100. Então calcule a inibição percentual como 100 menos a reação por cento. Para realizar um ensaio de tela de contador de detergente, adicione 300 microliters de óxido de deutério e 25 microliters de solução enzimática a um tubo de 15 mililitros contendo 2,59 mililitros de tampão de reação.Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação, e adicione dois microliters de detergente Triton X-100 a 20 mililitros de tampão de reação. Em seguida, adicione 2,59 mililitros de tampão de reação, contendo detergente Triton X-100 de 0,01% a um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 300 microliters de óxido de deutério e 25 microliters de solução enzimápica ao tubo.Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar a solução de estoque de reação. Então, determine a inibição percentual para os compostos de teste de 100 micromolares e 50 micromolares como apenas demonstrado. Utilizando a solução de estoque de reação sem detergente, para um conjunto de quatro tubos e a solução de estoque de reação com detergente para um segundo conjunto de quatro tubos.Para realizar uma diluição de salto, transfira 468 microliters de tampão de reação e 60 microliters de óxido de deutério para um tubo contendo 53,8 microliters de tampão de reação, cinco microliters de solução enzimática e 1,2 microliters de DMSO que vem incubando por 30 minutos. Aspire e dispense a mistura duas vezes de forma lenta, mas deliberada. Antes de transferir 468 microliters de tampão de reação e 60 microliters de óxido de deutério para um tubo contendo 53,8 microliters de tampão de reação, cinco microliters de solução enzimática e 1,2 microliters de composto de teste que vem incubando por 30 minutos.Misture a segunda reação duas vezes como demonstrado. E transfira imediatamente 588 microliters de solução do tubo de controle DMSO de diluição de salto para um tubo contendo 12 microlitadores de substrato com mistura. Continue transferindo 588 microliters do tubo composto de teste de diluição de salto, o tubo de controle DMSO não diluído, e o tubo composto de ensaio não diluído para cada um dos três tubos de 1,5 mililitros, contendo 12 microliters de substrato por tubo com mistura em intervalos de 30 segundos posteriormente.Em seguida, aguarde 30 minutos antes de saciar as reações, coletando o espectro de RMN e calculando a inibição percentual para cada composto como apenas demonstrado. Aqui os resultados para testar dois compostos contra AgNH em um ensaio composto de teste inicial usando NMR de prótons como demonstrado são mostrados. A reação enzimática é mais facilmente observada e quantificada pelo desaparecimento das ressonâncias singlet e doublet em 8,48 e 6,09 partes por milhão, respectivamente.E o aparecimento de uma residência adenina singlet a 8,33 partes por milhão, como observado no espectro de controle de 30 minutos. Nesta figura, os resultados para testar um composto em duas concentrações contra AgNH em um ensaio de contra-tela de detergente usando nMR de prótons como demonstrado são mostrados. Apenas diferenças mínimas são observadas nas intensidades do substrato e dos sinais do produto utilizando as duas condições, indicando que a inibição da enzima observada não é um artefato de agregação composta.Observe que as ressonâncias decorrentes do composto testado e do detergente não interferem nas ressonâncias do substrato ou do produto. Os resultados para testar um composto em um ensaio de diluição de salto contra a AGNH usando nMR de prótons como demonstrado revelam uma intensidade reduzida do sinal de substrato na reação de 20 micromolar em comparação com a reação de 200 micromolares, indicando que a inibição é reversível. Uma mistura completa de amostras durante o início de cada reação e para as diluições de salto é fundamental.É necessária uma aspiração e dispensação cuidadosa e consistente. Ensaios baseados em NMR também podem ser usados para medir a atividade enzimática em células inteiras, usando uma solução contendo células suspensas no lugar do tampão de reação e enzima. Nossos esforços de descoberta de drogas anti-trichomonais continuam a depender desses ensaios para medir a potência dos compostos recém-sintetizados contra as enzimas ribohidrolase.Embora seja usado em quantidades apenas muito pequenas, o ácido clorídrico usado para saciar as reações é perigoso e deve ser usado com o equipamento de proteção individual adequado.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state Pré-steady-state, e Single-turnover Medição, Kinetic para DNA glicosilase Atividade

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Química

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Determinando os planos de ligação de gelo de proteínas anticongelantes pela afinidade do plano de gelo baseado em fluorescência

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleosídeos Trisfosfatos - Da síntese à Caracterização Bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Um ensaio colorimétrico que mede Especificamente granzima B Actividade proteolítica: Hidrólise de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Desacetilação Ensaios para desvendar a interação entre Sirtuins (SIRT2) e Proteína-substratos específicos

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Caracterização, quantificação e específicos do Composto isotópica Análise de Pirogênica carbono, usando Benzeno policarboxílicos Acids (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

-HPLC baseado Ensaio para monitorar Extracelular Nucleotide / nucleosídeos Metabolismo em crônicas células de leucemia linfocítica Humanos

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Complexos de paládio N-heterocíclicos de carbeno: síntese a partir de sais de benzimidazólio e atividade catalítica em reações de formação de ligações carbono-carbono

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Medição simultânea de HDAC1 e atividade HDAC6 em HeLa células usando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...