Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Мы благодарим д-ра Дина Брауна за предоставление соединений из библиотеки фрагментов АстраЗенека и д-ра Дэвида Паркина за предоставление ферментов AGNH и UNH. Исследование, о которых сообщается в этой публикации, было поддержано Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения под номером премии R15AI128585 до B. J. S. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно представляют официальные взгляды Национальных институтов Health.Research также поддерживается Гораций Г. Макдонелл Летний научно-исследовательский стипендий присуждается С. Н. М., Ландесберг семьи Стипендия присуждена J. A. G., и гранты на развитие факультета и Фредерик Беттельхайм исследований премии от Университета Адельфи до B. J. S.

1. Первоначальные тестовые анализы на уровне 500 мкм и 250 мкм
<ol><li>Подготовка субстрата и испытания соединения для реакций.<ol>
<li>Подготовьте запасные растворы субстрата (аденозин или 5-фтороридин) в воде и испытательном комплексе 50 мМ в дейтерном диметилсулькидоксиде (ДМСО). Обратитесь к р...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Описанные протоколы, как правило, применимы ко многим ферментам, при условии, что субстраты и/или продукты имеют разрешимые сигналы в спектре ЯМР. Однако крайне важно, чтобы концентрация субстрата была близка к значению Km и была достаточно высокой, чтобы быть обнаруженной в э?...

Ядерная магнитно-резонансная (НМР) спектроскопия хорошозарекомендовала себя для характеристики и мониторинга ферментных реакций 1,2. Различия в химических сдвигов и связывая моделей используются для различения субстрата и резонансов продукта, а относительная интенсивность резонанса используется для количественной оценки процента реакции. Как потребление субстрата, так и создание продукта непосредственно наблюдаются в спектре ЯМР. Это контрастирует со спектрофотометрией или флуоресценцией спектроскопии, в которой время реакции указывается на изменение абсорбции, связанные с некоторыми химическими видами потребляется или создается. Так же, как с другими методами, ЯМР может быть использован для изучения ферментных реакций в качестве функции температуры, рН, или других условий раствора, и эффекты ингибиторов могут быть определены.
Совсем недавно, На основе ЯМР ферментной активности анализы были продемонстрирована для фрагмента скрининга3,4. Анализы на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений (часто до 1 мМ), необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это выгодно отличается от спектрофотометрических анализов, где проблемы ссчитывания помех часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Это преимущество делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционныеанализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки 5.
В нашей исследовательской лаборатории, На основе ЯМР анализы активности используются для выявления и оценки ингибиторов Trichomonas вагинального нуклеозида рибогидроласы. T. вагинальный паразит вызывает наиболее распространенные невирусные венерические заболевания6. Растущая устойчивость к существующим терапии7 является движущей необходимость новых, механизм на основе лечения, с основными нуклеозидных спасти пути ферментов, представляющих основные цели8. Анализы активности на основе ЯМР были разработаны как для пиримидин- и пурино-специфических ферментов, нуклеозидного арибогидролазы уридина (UNH)9, и аденозин/гуанозин предпочитая нуклеозид рибогидролазы (AGNH)10. Реакции, катализированные этими двумя ферментами, показаны на рисунке 1. Анализы NMR используются для проверки библиотек фрагментов для химических исходных точек, определения значений IC50 и отсечения агрегационных или ковалентных связывающих ингибиторов11. Те же ассисты также переводятся для оценки активности ферментов в целых клетках12.
Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, в котором субстрат и резонанспродукта продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Для простоты были сделаны три предположения. Во-первых, субстрат не указан. Для того чтобы анализы активности на основе ЯМР были полезными, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x значение Km 4. В приведенных примерах конечная концентрация аденозина и 5-фтороридинасоставляют 100 мкм (Км м 54 мкм) и 50 мм (Км 15 мКм), соответственно. В протоколах достижение этих концентраций соответствует 12 мл аденозина 5 мМ или 12 мЛ 2,5 мМ 5-фтороридина.
Во-вторых, количество фермента, предусмотренное в протоколах, 5 зЛ, было выбрано в соответствии с количеством, необходимым для преобразования субстрата примерно на 75% в продукт за 30 мин. Это количество обычно представляет собой большое разбавление из очищенного ферментного запаса, и разбавление должно быть определено заранее для каждого фермента. Очищенные растворы agNH и UNH ферментного запаса хранятся при -80 градусов по Цельсию в аликвотах, которые обеспечивают достаточное количество ферментов для нескольких тысяч реакций. Таким образом, коэффициент разбавления в идеале должен определяться или проверяться только каждые несколько месяцев. В-третьих, конкретный эксперимент 1D NMR не указан. В репрезентативных результатах показан 1H NMR для AGNH10 и 19F NMR для UNH9,при этом эксперимент ЯМР описан в соответствующих ссылках. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR. Наконец, следует отметить, что описанный экспериментальный подход не соответствует строгим требованиям количественных NMR (qNMR)13,14. В протоколе процентная реакция определяется с использованием относительных изменений интенсивности одного и того же резонанса в каждом спектре, а не путем определения абсолютных концентраций. Такой подход устраняет необходимость в модификациях для сбора и обработки данных, а также внутренних или внешних стандартов, которые необходимы для qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

Спектроскопия ЯМР часто используется для идентификации и характеристики ингибиторов ферментов при обнаружении лекарств, особенно в контексте фрагментного скрининга. Анализы активности на основе ЯМР идеально подходят для работы при более высоких концентрациях испытательных соединений, необходимых для обнаружения этих более слабых ингибиторов. Динамический диапазон и дисперсия химических сдвигов в эксперименте NMR могут легко разрешить резонансы от субстрата, продукта и испытательных соединений. Это контрастирует со спектрофотометрическими анализами, в которых проблемы считывания интерференции часто возникают из соединений с перекрывающимися УФ-вис абсорбционными профилями. Кроме того, поскольку им не хватает региней репортера, одноэнзимные анализы ЯМР не склонны к сочетанию с ложными срабатываниями. Этот атрибут делает их полезными в качестве ортогоналовых анализов, дополняя традиционные анализы скрининга высокой пропускной их связи и анализы сортировки скамейки. Подробные протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы-ответ анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик проверки экрана, скачок-разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки. Методы демонстрируются с использованием двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы. Использование 1H IMR показано для пурина-специфического фермента, в то время как 19F NMR показано для пиримидина-специфического фермента. Протоколы, как правило, применимы к любому ферменту, где субстрат и резонанс продукта могут наблюдаться и отличаться спектроскопией ЯМР. Чтобы быть наиболее полезным в контексте открытия препарата, конечная концентрация субстрата должна быть не более 2-3x его Kм значение. Выбор эксперимента ЯМР зависит от ферментной реакции и доступных субстратов, а также от доступных приборов NMR.

На рисунке 2 показаны результаты тестирования двух соединений против AGNH с использованием 1H NMR следующих разделов 1. Реакция фермента наиболее легко наблюдается и количественно исчезновение аденозин синглет и дублет резонансов на 8,48 промилле и 6,09 промилле, соответ...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

ЯМР-анализ ы активности для определения ингибирования соединения, IC50 Значения, Артефактная активность, и цельноклеточной активности нуклеозидных рибогидроласов

Для выявления и характеристики ингибиторов двух нуклеозидных ферментов рибогидролазы на основе ЯМР были разработаны анализы активности на основе ЯМР. Протоколы предусмотрены для первоначальных анализов соединения на 500 мкм и 250 мкм, дозы ответ ные анализы для определения значения IC50, моющее средство счетчик аспогеанализции экрана, скачок разбавления счетчик анализы экрана, и анализы в E. coli целые клетки.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Анализы активности на основе ЯМР обеспечивают эффективный метод выявления, оценки и проверки ингибиторов данного фермента. Они особенно хорошо подходят для скрининга фрагментов. Анализы ЯМР податрены для более высоких концентраций соединений, необходимых для более слабых ингибиторов.Кроме того, отсутствие ферментов репортера делает их менее склонными к ложным срабатываниям. Мы используем nmR анализы в нашей лаборатории, чтобы определить и охарактеризовать ингибиторы двух ферментов из Trichomonas vaginalis. Оба фермента представляют собой новые мишени для новых антитрихомональных препаратов.Анализы ЯМР, как правило, применимы к любой области исследований, которая включает в себя ферменты, и они даже могут быть использованы для изучения ферментов внутри клеток. Наиболее важными аспектами метода являются обеспечение того, чтобы правильные объемы реагентов были трубными и компоненты реакции тщательно перемешаны. Для подготовки субстрата и испытательных соединений добавьте 12 микролитров субстрата к каждому из четырех 1,5-миллилитровых микрофьюдж-трубок и добавьте шесть микролитров дейтерированных DMSO к нулевому минутному контролю и 30-минутным контрольным трубкам.Добавьте шесть микролитров испытательного соединения к первой экспериментальной трубке и три микролитера испытательного соединения и три микролитров дейтетерированного DMSO во вторую экспериментальную трубку. Затем добавьте 300 микролитров оксида дейтерия в 15-миллилитровую трубку, содержащую 2,59 миллилитров буфера реакции, а затем 25 микролитров ферментного раствора. Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать раствор реакции и добавить 10 микролитров 1,5 молярной соляной кислоты в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 582 микролитров раствора реакционной массы.Затем перенесите весь объем раствора реакции и кислоты в контрольную трубку с нулевой минутой, чтобы одновременно инициировать и утолить нулевую реакцию управления. Аспирация и распределение образца два раза в медленной, но преднамеренной манере. Инициировать и запустить оставшиеся три реакции в шахматном порядке, сразу же передачи 582 микролитров реакции фондового решения в первую экспериментальную трубку и смешивания образца в два раза, как только что продемонстрировано.Тщательное стремление и распределение обеспечивает полное смешивание во время этапов посвящения. Будьте в соответствии с каждой выборкой, чтобы обеспечить дифференциальное смешивание не является переменной. Через 30 секунд перенесите 582 микролитров раствора реакционной штока во вторую экспериментальную трубку и смешайте, а затем добавление еще 582 микролитров раствора реакционной штока в 30-минутную контрольную трубку через 30 секунд после начала реакции во второй экспериментальной трубке.Через 30 минут добавьте 10 микролитров 1,5-молярной соляной кислоты в первую экспериментальную трубку, повторяя затухание с 30-секундными интервалами для второй экспериментальной и 30-минутной контрольных трубок. Когда все реакции будут утоляются, перенесите 600 микролитров раствора из каждой реакции в трубки ЯМР. Чтобы вычислить процентное преобразование субстрата для контрольных спектров, загрузите образцы на спектрометр, соберите спектры ЯМР и наложить спектры на нулевой и 30-минутный элементы управления.Масштабировать сигнал субстрата в нулевой минуте управления, чтобы соответствовать 30-минутный контроль и отметить этот процент. Затем вычислите процентное преобразование как 100 минус процент от сопоставления сигналов субстрата. Чтобы рассчитать процентное преобразование субстрата для реакций, содержащих испытательное соединение, наложить спектры на контроль нулевой минуты и первую реакцию, содержащую 500-микромолярновое испытательное соединение, и масштабировать сигнал субстрата в нулевом минутном контроле, чтобы соответствовать спектру с тестовым соединением.Обратите внимание на этот процент и используйте его для расчета процентной конверсии, как это было продемонстрировано. Затем наложить спектры на контроль нулевой минуты и первую реакцию, содержащую 250-микромолярное испытательное соединение, и масштабировать сигнал субстрата в нулевом минутном контроле, чтобы соответствовать спектру с тестовым соединением. После того, как выявив процент, используйте его для расчета процентной конверсии.Чтобы вычислить процентную реакцию и процентное торможение для каждой концентрации соединения теста, во-первых, вычислить процент реакции, как процентное преобразование тестового соединения, разделенного на процент преобразования времени управления 100. Затем рассчитайте процентное торможение как 100 минус процентная реакция. Для выполнения анализа счетчика моющего средства добавьте 300 микролитров оксида дейтерия и 25 микролитров ферментного раствора в 15-миллилитровую трубку, содержащую 2,59 миллилитров буфера реакции.Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать раствор реакции фонда, и добавить два микролитров triton X-100 моющего средства до 20 миллилитров реакции буфера. Затем добавьте 2,59 миллилитров буфера реакции, содержащего 0,01%Triton X-100 моющее средство в новую 15-миллилитровую коническую трубку. Затем добавьте в трубку 300 микролитров оксида дейтерия и 25 микролитров ферментного раствора.Аккуратно инвертировать трубку два раза, чтобы смешать реакционной фондовой раствор. Затем определите процентное ингибирование 100-микромолярных и 50-микромоляных тестовых соединений, как это было продемонстрировано. Использование раствора запаса реакции без моющего средства, для одного набора из четырех трубок и раствора запаса реакции с моющим средством для второго набора из четырех трубок.Для выполнения скачко-разбавления перенесите 468 микролитров буфера реакции и 60 микролитров оксида дейтерия в трубку, содержащую 53,8 микролитров буфера реакции, пять микролитров ферментного раствора и 1,2 микролитров DMSO, которые инкубируют в течение 30 минут. Аспирировать и распределять смесь два раза в медленной, но преднамеренной манере. Перед передачей 468 микролитров буфера реакции и 60 микролитров оксида дейтерия в трубку, содержащую 53,8 микролитров буфера реакции, пять микролитров ферментного раствора и 1,2 микролитера испытательного соединения, которые инкубируют в течение 30 минут.Смешайте вторую реакцию два раза, как попродемонстрировано. И сразу же перенесите 588 микролитров раствора из трубки управления ДМСО для скачок в трубку, содержащую 12 микролитров субстрата со смешиванием. Продолжить передачу 588 микролитров из прыжка разбавления пробной трубки, неразбавленной DMSO трубки управления, и неразбавленный пробирки соединения трубки для каждого из трех 1,5-миллилитровых труб, содержащих 12 микролитров субстрата на трубку с смешиванием с 30-секундными интервалами после этого.Затем подождите 30 минут, прежде чем утолить реакции, собирая спектры ЯМР и вычисляя процентное торможение для каждого соединения, как только что продемонстрировано. Здесь показаны результаты тестирования двух соединений против AgNH в первоначальном тестовом анализе соединения с использованием протонной ЯМР, как показано на фото. Ферментная реакция наиболее легко наблюдается и количественно по исчезновению аденозина синглет и дублет резонансов на 8,48 и 6,09 частей на миллион соответственно.И появление аденин синглетного места жительства на 8,33 частей на миллион, как это наблюдается в 30-минутном контрольном спектре. На этом рисунке показаны результаты тестирования соединения в двух концентрациях против AgNH в анализе счетчика моющих средств с использованием протонной ЯМР, как показано на рисунке. Только минимальные различия наблюдаются в интенсивности субстрата и сигналов продукта, используя эти два условия, что указывает на то, что наблюдаемое ингибирование ферментов не является артефактом агрегации соединения.Обратите внимание, что резонансы, возникающие в результате испытания соединения и моющего средства, не мешают субстрату или резонансам продукта. Результаты тестирования соединения в скачок разбавления анализ против AGNH с использованием протонного ЯМР, как попродемонстрировано выявить снижение интенсивности сигнала субстрата в 20-микромолянной реакции по сравнению с 200-микромолянной реакции, что свидетельствует о том, что ингибирование обратимо. Полный образец смешивания во время начала каждой реакции и для скачка разбавления имеет решающее значение.Требуется тщательное и последовательное стремление и распределение. Анализы на основе ЯМР также могут быть использованы для измерения активности ферментов в целых клетках, используя раствор, содержащий подвесные клетки вместо буфера реакции и фермента. Наши усилия по открытию антитрихомональных препаратов продолжают полагаться на эти анализы для измерения потенции вновь синтезированных соединений против ферментов рибогидролаза.Несмотря на то, что она используется только в очень небольших количествах, соляная кислота, используемая для утоления реакций, опасна и должна использоваться с надлежащим защитным оборудованием.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Стационарная, Pre-стационарная, и односпальная кровать-оборота кинетические измерения активности ДНК гликозилаза

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Определение ледовязающих плоскостей антифризовых белков с помощью флуоресценции на основе аффинити ледовой плоскости

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Нуклеозидтрифосфатов - от синтеза до биохимической характеризации

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Флуоресценции основе Контроль PAD4 деятельности через Pro-флуоресцентной субстрата Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Колориметрический анализ, что меры частности Гранзим протеолитической активности: Гидролиз Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Деацетилирование Assays распутать Interplay между Sirtuins (SIRT2) и специфического белка-субстратов

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Характеристика, Количественное и соединение конкретных изотопный анализ пирогенного углерода с использованием Бензол поликарбоновых кислот (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

ВЭЖХ на основе анализа для мониторинга внеклеточного нуклеотидную / нуклеозид Метаболизм в человека хронический лимфолейкоз клеток

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

палладий<em&gt; N</em&gt; -Гетероциклические карбеновые комплексы: синтез из бензимидазолиевых солей и каталитическая активность в углерод-углеродных связующих реакциях

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Одновременное измерение HDAC1 и HDAC6 активности в НеЬа клетки с помощью UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...