Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Agradecemos al Dr. Dean Brown por proporcionar compuestos de la biblioteca de fragmentos de AstraZeneca y al Dr. David Parkin por proporcionar las enzimas AGNH y UNH. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R15AI128585 a B. J. S. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.La investigación también fue apoyada por una beca de investigación de verano Horace G. McDonell otorgada a S. N. M., una familia Landesberg Beca otorgada a J. A. G., y Becas de Desarrollo Docente y Premio de Investigación Frederick Bettelheim de la Universidad de Adelphi a B. J. S.

1. Ensayos compuestos de ensayo inicial a 500 m y 250 m
<ol><li>Preparar el sustrato y el compuesto de prueba para las reacciones.<ol>
<li>Preparar soluciones de stock de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) en agua y compuesto de prueba de 50 mM en dimetilsulfóxido desentramado (DMSO). Consulte la sección de introducción para conocer las concentraciones de solución de sustrato a utilizar.</li>
		<li>Añadir 12 ml de sustrato (adenosina o 5-fluorouridina) a cada uno de los cuatro tubos de microfusión de 1,5 ml, ...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Los protocolos descritos son generalmente aplicables a muchas enzimas, siempre que los sustratos y/o productos tengan señales resoluibles en el espectro de RMN. Sin embargo, es fundamental que la concentración de sustrato esté cerca de su valor Km y lo suficientemente alta como para ser detectada en un experimento de RMN dentro de un período de tiempo razonable. Una concentración de sustrato no superior a 2-3 x el valor Km es óptima para detectar inhibidores competitivos, no ...

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) está bien establecida para caracterizar y controlar las reacciones enzimáticas1,2. Las diferencias en los cambios químicos y los patrones de acoplamiento se utilizan para distinguir las resonancias de sustratos y productos, y se utilizan intensidades de resonancia relativas para cuantificar el porcentaje de reacción. Tanto el consumo de sustrato como la creación del producto se observan directamente en el espectro de RMN. Esto contrasta con la espectrofotometría o espectroscopia de fluorescencia, en la que el curso del tiempo de reacción se indica por un cambio en la absorbancia atribuible a algunas especies químicas que se consumen o crean. Al igual que con los otros métodos, la RMN se puede utilizar para estudiar las reacciones enzimáticas en función de la temperatura, el pH u otras condiciones de la solución, y se pueden determinar los efectos de los inhibidores.
Más recientemente, se han demostrado ensayos de actividad enzimática basados en RMN para el cribado de fragmentos3,4. Los ensayos basados en RMN son ideales para trabajar a concentraciones más altas de compuestos de ensayo (a menudo hasta 1 mM) necesarios para detectar estos inhibidores más débiles. El rango dinámico y la dispersión de cambios químicos en el experimento de RMN pueden resolver fácilmente las resonancias de sustrato, producto y compuestos de prueba. Esto se compara favorablemente con los ensayos espectrofotométricos donde los problemas de interferencia de lectura a menudo surgen de compuestos con perfiles de absorción UV-vis superpuestos. Además, dado que carecen de enzimas de reportero, los ensayos de RMN de una sola enzima no son propensos a falsos positivos de ensayo acoplado. Esta ventaja los hace útiles como ensayos ortogonales, complementando losensayos tradicionales de cribado de alto rendimiento y los ensayos de triaje de sobremesa 5.
En nuestro laboratorio de investigación, los ensayos de actividad basados en RMN se utilizan para identificar y evaluar inhibidores de las ribohidrolasas nucleósidos trichomonas vaginales. El parásito T. vaginalis causa la enfermedad de transmisión sexual no viral más prevalente6. El aumento de la resistencia a las terapias existentes7 está impulsando la necesidad de nuevos tratamientos basados en mecanismos, con enzimas esenciales de la vía de salvamento de nucleósidos que representan objetivos principales8. Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN tanto para enzimas específicas de pirimidina como para purina, ribohidrolasa de nucleósido de uridina (UNH)9y adenosina/guanosina que prefiriendo ribohidrolasa nucleósido (AGNH)10. Las reacciones catalizadas por estas dos enzimas se muestran en la Figura1. Los ensayos de RMN se utilizan para examinar bibliotecas de fragmentos para puntos de partida químicos, determinar valores IC50 e eliminar los inhibidores de unión covalente o basados en la agregación11. Los mismos ensayos también se están traduciendo para evaluar la actividad enzimática en células enteras12.
Se proporcionan protocolos detallados para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de saltos-dilución y ensayos en células enteras de E. coli. Los protocolos son generalmente aplicables a cualquier enzima en la que las resonancias de sustrato y producto pueden ser observadas y distinguidas por espectroscopia de RMN. Se han hecho tres suposiciones para la simplicidad. En primer lugar, no se especifica el sustrato. Para que los ensayos de actividad basados en RMN sean útiles, la concentración final de sustrato no debe ser superior a 2-3 veces el valor Km 4. En los ejemplos mostrados, las concentraciones finales de adenosina y5-fluorouridina son de 100 m (Km a 54 m) y 50 m (Km a 15 m), respectivamente. En los protocolos, el logro de estas concentraciones corresponde a 12 ml de adenosina de 5 mM o 12 oL de 2,5 mM 5-fluorouridina.
En segundo lugar, se eligió la cantidad de enzima prevista en los protocolos, de 5 ml, para corresponder a la cantidad necesaria para dar lugar a una conversión aproximada del 75% del sustrato al producto en 30 min. Esta cantidad normalmente representa una gran dilución de un stock de enzimas purificadas, y la dilución debe determinarse de antemano para cada enzima. Las soluciones de stock de enzimas AGNH y UNH purificadas se almacenan a -80 oC en alícuotas que proporcionan suficiente enzima para varios miles de reacciones. Por lo tanto, el factor de dilución idealmente sólo necesita ser determinado o validado cada pocos meses. En tercer lugar, no se especifica el experimento específico de RMN 1D. En los resultados representativos, se muestra 1H NMR para AGNH10 y 19F NMR para UNH9, con el experimento de RMN descrito en las referencias correspondientes. La elección del experimento de RMN depende de la reacción enzimática y los sustratos disponibles, así como de la instrumentación de RMN disponible. Por último, cabe señalar que el enfoque experimental descrito no se adhiere a los estrictos requisitos de RMN cuantitativa (qNMR)13,14. En el protocolo, se determina una reacción porcentual utilizando los cambios relativos en la intensidad de la misma resonancia en cada espectro, en lugar de determinar las concentraciones absolutas. Este enfoque elimina la necesidad de adquisición de datos y modificaciones de procesamiento, así como estándares internos o externos, que son necesarios para qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

La espectroscopia de RMN se utiliza a menudo para la identificación y caracterización de inhibidores de enzimas en el descubrimiento de fármacos, particularmente en el contexto de la detección de fragmentos. Los ensayos de actividad basados en RMN son ideales para trabajar a concentraciones más altas de compuestos de ensayo necesarios para detectar estos inhibidores más débiles. El rango dinámico y la dispersión de cambios químicos en un experimento de RMN pueden resolver fácilmente las resonancias de sustrato, producto y compuestos de prueba. Esto contrasta con los ensayos espectrofotométricos, en los que los problemas de interferencia de lectura a menudo surgen de compuestos con perfiles de absorción UV-vis superpuestos. Además, dado que carecen de enzimas de reportero, los ensayos de RMN de una sola enzima no son propensos a falsos positivos de ensayo acoplado. Este atributo los hace útiles como ensayos ortogonales, complementando los ensayos tradicionales de cribado de alto rendimiento y los ensayos de triaje de sobremesa. Se proporcionan protocolos detallados para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de saltos-dilución y ensayos en células enteras de E. coli. Los métodos se demuestran utilizando dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. El uso de 1Rmn H se muestra para la enzima específica de la purina, mientras que la RMN de 19F se muestra para la enzima específica de la pirimidina. Los protocolos son generalmente aplicables a cualquier enzima donde las resonancias de sustrato y producto pueden ser observadas y distinguidas por espectroscopia de RMN. Para ser el más útil en el contexto del descubrimiento de fármacos, la concentración final de sustrato no debe ser superior a 2-3x su valor Km. La elección del experimento de RMN depende de la reacción enzimática y los sustratos disponibles, así como de la instrumentación de RMN disponible.

La Figura 2 muestra los resultados para la prueba de dos compuestos contra AGNH utilizando 1H NMR siguiente sección 1. La reacción enzimática se observa y cuantifica más fácilmente por la desaparición de resonancias de adenosina singlet y doblete a 8,48 ppm y 6,09 ppm, respectivamente, y la aparición de una resonancia singlet de adenina a 8,33 ppm como se observa en el control de 30 minutos Espectro. En presencia de 500 M compuesto 1, no se forma ningún producto como lo de...

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NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Ensayos de actividad basados en RMN para determinar la inhibición compuesta, valores IC50, actividad artifefectiva y actividad de células enteras de ribohidrolasas de nucleósidos

Se han desarrollado ensayos de actividad basados en RMN para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas ribohidrolasas nucleósidos. Se proporcionan protocolos para ensayos compuestos iniciales a 500 m y 250 m, ensayos de dosis-respuesta para determinar los valores de IC50, ensayos de pantalla de contador de detergente, ensayos de pantalla de contador de dilución de salto y ensayos en células enteras de E. coli.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

Los ensayos de actividad basados en RMN proporcionan un método eficaz para identificar, evaluar y validar inhibidores para una enzima determinada. Son particularmente adecuados para la detección de fragmentos. Los ensayos de RMN son susceptibles a las concentraciones compuestas más altas requeridas para los inhibidores más débiles.Además, la falta de enzimas reporteras las hace menos propensas a falsos positivos. Utilizamos los ensayos de RMN en nuestro laboratorio para identificar y caracterizar los inhibidores de dos enzimas de Trichomonas vaginalis. Ambas enzimas representan nuevos objetivos para nuevos fármacos antireleccomonales.Los ensayos de RMN son generalmente aplicables a cualquier área de investigación que involucre enzimas, e incluso se pueden utilizar para estudiar las enzimas dentro de las células. Los aspectos más importantes de la técnica son asegurar que los volúmenes de reactivos correctos se pipetean y los componentes de reacción se mezclan a fondo. Para preparar el sustrato y los compuestos de ensayo, añada 12 microlitros de sustrato a cada uno de los cuatro tubos de microfug entre 1,5 mililitros y añada seis microlitros de DMSO deuterado al control de cero minutos y a los tubos de control de 30 minutos.Agregue seis microlitros del compuesto de ensayo al primer tubo experimental y tres microlitros del compuesto de ensayo y tres microlitros de DMSO deuterado al segundo tubo experimental. A continuación, añada 300 microlitros de óxido de deuterio a un tubo de 15 mililitros que contenga 2,59 mililitros de tampón de reacción, seguido de 25 microlitros de solución enzimática. Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción y agregue 10 microlitros de ácido clorhídrico 1,5 molar a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 582 microlitros de solución de material de reacción.A continuación, transfiera todo el volumen de solución de material de reacción y ácido al tubo de control de minuto cero para iniciar y apagar simultáneamente la reacción de control de cero minutos. Aspirar y dispensar la muestra dos veces de forma lenta pero deliberada. Inicie y ejecute las tres reacciones restantes de manera escalonada, transfiriendo inmediatamente 582 microlitros de la solución de material de reacción al primer tubo experimental y mezclando la muestra dos veces como se acaba de demostrar.Una aspiración y dosificación cuidadosas aseguran una mezcla completa durante los pasos de iniciación. Sea coherente con cada muestra para garantizar que la mezcla diferencial no sea una variable. Después de 30 segundos, transfiera 582 microlitros de solución de material de reacción al segundo tubo experimental y mezcle, seguido de la adición de otros 582 microlitros de solución de stock de reacción al tubo de control de 30 minutos 30 segundos después de iniciar la reacción en el segundo tubo experimental.Después de 30 minutos, añadir 10 microlitros de ácido clorhídrico de 1,5 molar al primer tubo experimental, repitiendo el temple a intervalos de 30 segundos para los segundos tubos de control experimentales y de 30 minutos. Cuando todas las reacciones hayan sido apagadas, transfiera 600 microlitros de solución de cada reacción a tubos de RMN. Para calcular el porcentaje de conversión del sustrato para los espectros de control, cargue las muestras en el espectrómetro, recopile los espectros de RMN y superponga los espectros para los controles de cero y 30 minutos.Escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el control de 30 minutos y observe este porcentaje. A continuación, calcule la conversión porcentual como 100 menos el porcentaje de la coincidencia de las señales de sustrato. Para calcular el porcentaje de conversión del sustrato para las reacciones que contienen el compuesto de prueba, superponga los espectros para el control de minuto cero y la primera reacción que contiene el compuesto de prueba de 500 micromolares y escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el espectro con el compuesto de prueba.Tenga en cuenta este porcentaje y utilícelo para calcular la conversión de porcentaje como se acaba de demostrar. A continuación, superponga los espectros para el control de minuto cero y la primera reacción que contiene el compuesto de prueba de 250 micromolares, y escale la señal de sustrato en el control de minuto cero para que coincida con el espectro con el compuesto de prueba. Después de tener en cuenta el porcentaje, utilícelo para calcular la conversión de porcentaje.Para calcular la reacción porcentual y la inhibición porcentual para cada concentración compuesta de prueba, primero, calcule la reacción porcentual como la conversión porcentual del compuesto de prueba, dividido por la conversión porcentual de los tiempos de control 100. A continuación, calcule el porcentaje de inhibición como 100 menos la reacción porcentual. Para realizar un ensayo de pantalla de contador de detergente, añada 300 microlitros de óxido de deuterio y 25 microlitros de solución enzimática a un tubo de 15 mililitros que contenga 2,59 mililitros de tampón de reacción.Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción y agregue dos microlitros de detergente Triton X-100 a 20 mililitros de tampón de reacción. A continuación, añada 2,59 mililitros de tampón de reacción, que contengan un 0,01%De detergente Tritón X-100 a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, agregue 300 microlitros de óxido de deuterio y 25 microlitros de solución enzimática al tubo.Invierta suavemente el tubo dos veces para mezclar la solución de material de reacción. Entonces, determinar el porcentaje de inhibición para los compuestos de prueba de 100 micromolares y 50 micromolares como se acaba de demostrar. Utilizar la solución de material de reacción sin detergente, para un conjunto de cuatro tubos y la solución de material de reacción con detergente para un segundo juego de cuatro tubos.Para realizar una dilución de salto, transfiera 468 microlitros de tampón de reacción y 60 microlitros de óxido de deuterio a un tubo que contenga 53,8 microlitros de tampón de reacción, cinco microlitros de solución enzimática y 1,2 microlitros de DMSO que ha estado incubando durante 30 minutos. Aspirar y dispensar la mezcla dos veces de forma lenta, pero deliberada. Antes de transferir 468 microlitros de tampón de reacción y 60 microlitros de óxido de deuterio a un tubo que contiene 53,8 microlitros de tampón de reacción, cinco microlitros de solución enzimática y 1,2 microlitros de compuesto de ensayo que ha estado incubando durante 30 minutos.Mezclar la segunda reacción dos veces como se ha demostrado. Y transfiera inmediatamente 588 microlitros de solución desde el tubo de control DMSO de salto-dilución a un tubo que contenga 12 microlitros de sustrato con mezcla. Continúe transfiriendo 588 microlitros desde el tubo compuesto de ensayo de salto-dilución, el tubo de control DMSO sin diluir y el tubo compuesto de ensayo sin diluir a cada uno de los tres tubos de 1,5 mililitros, que contienen 12 microlitros de sustrato por tubo con mezcla a intervalos de 30 segundos a partir de entonces.A continuación, espere 30 minutos antes de apagar las reacciones, recoger los espectros de RMN, y calcular el porcentaje de inhibición para cada compuesto como acaba de demostrar. Aquí se muestran los resultados para probar dos compuestos contra AgNH en un ensayo compuesto de prueba inicial utilizando RMN de protones como se ha demostrado. La reacción enzimática se observa y cuantifica más fácilmente por la desaparición de las resonancias de singlete y doblete de adenosina a 8,48 y 6,09 partes por millón, respectivamente.Y la aparición de una residencia unifamiliar adenina a 8,33 partes por millón como se observa en el espectro de control de 30 minutos. En esta figura, se muestran los resultados para probar un compuesto en dos concentraciones contra AgNH en un ensayo de contrapantalla detergente utilizando la RMN de protones como se ha demostrado. Sólo se observan diferencias mínimas en las intensidades del sustrato y las señales del producto utilizando las dos condiciones, lo que indica que la inhibición de la enzima observada no es un artefacto de agregación compuesta.Tenga en cuenta que las resonancias derivadas del compuesto probado y el detergente no interfieren con el sustrato o las resonancias del producto. Los resultados para probar un compuesto en un ensayo de salto-dilución contra AGNH utilizando la RMN de protones como se ha demostrado revelan una intensidad reducida de la señal de sustrato en la reacción de 20 micromolares en comparación con la reacción de 200 micromolares, lo que indica que la inhibición es reversible. Una mezcla de muestra completa durante el inicio de cada reacción y para las diluciones de salto es fundamental.Se requiere una aspiración y dispensación cuidadosa y consistente. Los ensayos basados en RMN también se pueden utilizar para medir la actividad enzimática en células enteras, utilizando una solución que contiene células suspendidas en lugar del tampón de reacción y la enzima. Nuestros esfuerzos de descubrimiento de fármacos anti-tricomonales continúan confiando en estos ensayos para medir la potencia de los compuestos recién sintetizados contra las enzimas ribohidrinasa.A pesar de que se utiliza en cantidades muy pequeñas, el ácido clorhídrico utilizado para apagar las reacciones es peligroso y debe utilizarse con el equipo de protección personal adecuado.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Medición cinética de estado estable, Pre-estado de equilibrio, y un solo volumen de negocios de ADN glicosilasa Actividad

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Investigación

Química

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

La Determinación De Los Planos De Unión Al Hielo De Las Proteínas Anticongelante Por La Afinidad De Plano De Hielo Basado En Fluorescencia

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nucleósidos Trifosfatos - De la síntesis a la Caracterización bioquímica

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Un ensayo colorimétrico que mide específicamente granzima B actividad proteolítica: La hidrólisis de Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Ensayos de desacetilación para desentrañar la interacción entre las sirtuinas (SIRT2) y proteína-sustratos específicos

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Caracterización, cuantificación y compuesto específico análisis isotópico de carbono Pirogenica utilizando benceno policarboxílicos (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

Ensayo basado en HPLC para supervisar extracelular de nucleótidos / nucleósidos de metabolismo en las células de la leucemia crónica humana linfocítica

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Paladio<em&gt; N</em&gt; -Heterocíclicos de los complejos de carburo: Síntesis a partir de sales de benzimidazolio y actividad catalítica en las reacciones de formación de enlaces carbono-carbono

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Medición simultánea de HDAC1 y HDAC6 actividad en HeLa células usando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...