Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Vi tackar Dr Dean Brown för att tillhandahålla föreningar från AstraZeneca fragment biblioteket och Dr David Parkin för att ge AGNH och UNH enzymer. Forskning som rapporter ATS i denna publikation stöddes av det nationella institutet för allergi-och infektions sjukdomar vid nationella hälso institut under Award Number R15AI128585 till B. J. S. Innehållet är ensamt ansvaret för författarna och inte nödvändigt vis företräder de officiella synpunkter från de nationella instituten för hälsa. Research stöddes också av en Horace G. McDonell Summer Research stipendium tilldelas S. N. M., en Landesberg familj Stipendium tilldelas J. A. G., och fakultets utvecklings bidrag och Frederick Bettelheim Research Award från Adelphi University till B. J. S.

1. inledande test sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM
<ol><li>Förbered substrat och test förening för reaktioner.<ol>
<li>Bered stam lösningar av substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) i vatten och 50 mM test substans i deutera dimetylsulfoxid (DMSO). Se inlednings avsnittet för koncentrationer av substrat lösning att använda.</li>
		<li>Tillsätt 12 μL substrat (adenosin eller 5-fluorouridin) till vart och ett av fyra 1,5 mL mikrofugerör, 1 – 4.</li>
		<li>Tillsätt 6 μL deuterat DMSO till rör ...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

De beskrivna protokollen är allmänt tillämpliga på många enzymer, förutsatt att substrat och/eller produkter har matchas signaler i NMR-spektrumet. Det är dock viktigt att koncentrationen av substrat ligger nära sitt Km -värde och tillräckligt hög för att upptäckas i ett NMR-experiment inom en rimlig tidsram. En substrat koncentration som inte är högre än 2-3x Km -värdet är optimalt för att upptäcka konkurrens kraftiga, icke-konkurrenshämmande och icke-konkurre...

Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är väl etablerad för karakterisering och övervakning enzym reaktioner1,2. Skillnader i kemiska SKIFT och kopplings mönster används för att särskilja substrat och produkt resonanser, och relativ resonans intensitet används för att kvantifiera procent av reaktionen. Både förbrukningen av substrat och skapandet av produkten observeras direkt i NMR spektrum. Detta kontrasterar mot spektrofotometri eller fluorescensspektroskopi, där reaktions tiden indikeras av en förändring i absorbansen som kan hänföras till vissa kemiska arter som konsumeras eller skapas. Precis som med andra metoder, NMR kan användas för att studera enzym reaktioner som en funktion av temperatur, pH, eller andra lösnings villkor, och effekterna av inhibitorer kan bestämmas.
På senare tid har NMR-baserade enzym aktivitets analyser visats för fragment screening3,4. NMR-baserade analyser är idealiska för att arbeta vid de högre koncentrationerna av test föreningar (ofta så höga som 1 mM) som krävs för att upptäcka dessa svagare hämmare. Det dynamiska omfånget och spridningen av kemisk förskjutning i NMR-experimentet kan enkelt lösa resonanser från substrat-, produkt-och test föreningar. Detta jämför positivt med spektrofotometriska analyser där utläsnings störningar ofta uppstår från föreningar med överlappande UV-VIS absorptionsprofiler. Dessutom, eftersom de saknar reporter enzymer, den enda enzym NMR-analyser är inte benägna att kopplade-assay falska positiva identifieringar. Denna fördel gör dem användbara som ortogonala analyser, kompletterar traditionella hög genom strömning screening analyser och bänkmonterade triage analyser5.
I vårt forsknings laboratorium används NMR-baserade aktivitets analyser för att identifiera och utvärdera hämmare av Trichomonas vaginalis nukleosidribohydrolaser. Den T. vaginalis parasit orsakar de vanligaste icke-viral sexuellt överförbara sjukdomar6. Ökad resistens mot befintliga terapier7 driver behovet av nya, mekanismbaserade behandlingar, med viktiga nukleosid bärgning utbildningsavsnitt enzymer som representerar Prime mål8. NMR-baserade aktivitets analyser har utvecklats för både pyrimidin-och purinspecifika enzymer, uridinnukleosidribohydrolas (UNH)9, och adenosin/guanosin som föredrar nukleosidribohydrolas (agnh)10. De reaktioner som katalyseras av dessa två enzymer visas i figur 1. NMR-analyserna används för att avskärma fragmentbiblioteken för kemiska start punkter, fastställa IC50 -värden och rensa agg regeringsbaserade eller kovalent bindande hämmare11. Samma analyser översätts också för att bedöma enzym aktivitet i hela celler12.
Detaljerade protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare, test av avskärmnings räknare, Jump-utspädningstester och analyser i E. coli -helceller. Protokollen är i allmänhet tillämpliga på alla enzym där substrat-och produkt resonanser kan observeras och särskiljas genom NMR-spektroskopi. Tre antaganden har gjorts för enkelhetens skull. Först anges inte substratet. För NMR-baserad aktivitet analyser att vara användbara, den slutliga koncentrationen av substrat bör inte vara mer än 2-3x Km värde4. I de exempel som visas är de slutliga koncentrationerna av adenosin och 5-fluorouridin 100 μM (km = 54 μM) och 50 μm (km = 15 μm). Att uppnå dessa koncentrationer i protokollen motsvarar 12 μL 5 mM adenosin eller 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridin.
För det andra valdes den mängd enzym som föreskrivs i protokollen, 5 μL, till att motsvara det belopp som krävs för att resultera i cirka 75% omvandling av substrat till produkten på 30 min. Denna mängd motsvarar vanligt vis en stor utspädning från ett renat enzym bestånd, och spädningen måste bestämmas i förväg för varje enzym. Renas AGNH och UNH enzym lager lösningar lagras vid-80 ° c i Ali kvoter som ger tillräckligt enzym för flera tusen reaktioner. Därför behöver utspädnings faktorn helst endast bestämmas eller val IDE ras med några månaders mellanrum. För det tredje har det specifika 1D NMR-experimentet inte angetts. I representativa resultat visas 1H NMR för agnh10 och 19F NMR visas för UNH9, med NMR-experimentet som beskrivs i motsvarande referenser. Valet av NMR experiment beror på enzymet reaktion och substrat tillgängliga samt tillgängliga NMR instrumentering. Slutligen bör det påpekas att den beskrivna experimentella metoden inte följer de stränga kraven i kvantitativ NMR (qnmr)13,14. I protokollet bestäms en procentuell reaktion med hjälp av de relativa förändringarna i intensitet av samma resonans i varje spektrum, snarare än genom bestämning av absoluta koncentrationer. Detta tillvägagångs sätt eliminerar behovet av data insamling och bearbetning ändringar samt interna eller externa standarder, som krävs för qNMR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR spektroskopi används ofta för identifiering och karakterisering av enzym hämmare i Drug discovery, särskilt i samband med fragment screening. NMR-baserade aktivitets analyser är idealiska för att arbeta vid de högre koncentrationer av test föreningar som krävs för att upptäcka dessa svagare hämmare. Det dynamiska omfånget och spridningen av kemisk förskjutning i ett NMR-experiment kan enkelt lösa resonanser från substrat-, produkt-och test föreningar. Detta kontrasterar mot spektrofotometriska analyser, där problem med utläsnings störningar ofta uppstår från föreningar med överlappande UV-VIS absorptionsprofiler. Dessutom, eftersom de saknar reporter enzymer, den enda enzym NMR-analyser är inte benägna att kopplade-assay falska positiva identifieringar. Detta attribut gör dem användbara som ortogonala analyser, kompletterar traditionella hög genom strömning screening analyser och bänkmonterade triage analyser. Detaljerade protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare, test av avskärmnings räknare, Jump-utspädningstester och analyser i E. coli -helceller. Metoderna demonstreras med hjälp av två nukleosidribohydrolase-enzymer. Användning av 1H NMR visas för det purinspecifika enzymet, medan 19F NMR visas för det pyrimidinspecifika enzymet. Protokollen är i allmänhet tillämpliga på alla enzym där substrat-och produkt resonanser kan observeras och särskiljas genom NMR-spektroskopi. För att vara den mest användbara i samband med läkemedels upptäckt, bör den slutliga koncentrationen av substrat inte vara mer än 2-3x sitt Km -värde. Valet av NMR experiment beror på enzymet reaktion och substrat tillgängliga samt tillgängliga NMR instrumentering.

Figur 2 visar resultaten för att testa två föreningar mot agnh med 1H NMR enligt avsnitt 1. Enzymet reaktion är lättast observeras och kvantifieras av försvinnandet av adenosin singlet och Doublet resonanser vid 8,48 ppm och 6,09 ppm, respektive, och utseendet på en adenin singlet resonans vid 8,33 ppm som observerats i 30 min kontroll Spektrum. I närvaro av 500 μM sammansatta 1, ingen produkt bildas som framgår av avsaknaden av en adenin resonans vid 8,33 ppm. I närvar...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR-baserade aktivitets analyser för bestämning av sammansatt hämning, IC50 -värden, artifaktuella aktiviteter och helcellsaktivitet av Nukleosidribohydrolaser

NMR-baserade aktivitets analyser har utvecklats för att identifiera och karakterisera hämmare av två nukleosidribohydrolase-enzymer. Protokoll tillhandahålls för initiala sammansatta analyser vid 500 μM och 250 μM, DOS-respons-analyser för bestämning av IC50 -värden, disk medels räknare skärm analyser, hopp utspädning Counter-Screen analyser, och analyser i E. coli hela celler.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR-baserade aktivitetsanalyser ger en effektiv metod för att identifiera, utvärdera, och validera hämmare för ett givet enzym. De är särskilt väl lämpade för fragmentscreening. NMR-analyser är mottagliga för de högre sammansatta koncentrationer som krävs för svagare hämmare.Dessutom gör bristen på reporterenzymer dem mindre benägna att falska positiva. Vi använder NMR-analyserna i vårt labb för att identifiera och karakterisera hämmarna av två enzymer från Trichomonas vaginalis. Båda enzymerna representerar nya mål för nya anti-trichomonal läkemedel.De NMR-analyser är i allmänhet tillämpliga på alla forskningsområden som involverar enzymer, och de kan även användas för att studera enzymerna inuti celler. De viktigaste aspekterna av tekniken är att säkerställa att de korrekta reagensvolymerna pipetteras och reaktionskomponenterna blandas noggrant. För att förbereda substratet och testa föreningar, tillsätt 12 mikroliter substrat till var och en av fyra 1,5-milliliter mikrofugeringsrör och tillsätt sex mikroliter av deutarerade DMSO till zero-minute control och 30-minuters styrrör.Tillsätt sex mikroliter av testföreningen till det första experimentella röret och tre mikroliter av testföreningen och tre mikroliter av deuterated DMSO till det andra experimentella röret. Därefter lägger du till 300 mikroliter av deuteriumoxid till ett 15-milliliterrör som innehåller 2,59 milliliter reaktionsbuffert, följt av 25 mikroliter enzymlösning. Försiktigt invertera röret två gånger för att blanda reaktions stamlösning och tillsätt 10 mikroliter av 1,5 molar saltsyra till en 1,5-milliliter rör som innehåller 582 mikroliter reaktion stamlösning.Därefter överför du hela volymen reaktionslagerlösning och -syra till kontrollröret för nollminuter för att samtidigt initiera och släcka kontrollreaktionen på nollminuter. Aspirera och dispensering provet två gånger på ett långsamt men medvetet sätt. Initiera och kör de återstående tre reaktionerna i förskjutet sätt, omedelbart överföra 582 mikroliter av reaktions stamlösningen till den första experimentella röret och blanda provet två gånger som just visat.En noggrann aspiration och dispensering garanterar en fullständig blandning under initieringsstegen. Var konsekvent med varje prov för att säkerställa differentiell blandning är inte en variabel. Efter 30 sekunder överför 582 mikroliter reaktionslagerlösning till det andra experimentella röret och blandningen, följt av tillägg av ytterligare 582 mikroliter av reaktionslagerlösning till 30-minuters kontrollröret 30 sekunder efter att reaktionen i det andra försöksröret har inletts.Efter 30 minuter, tillsätt 10 mikroliter 1,5-molar saltsyra till den första experimentella röret, upprepa släckningen med 30-sekunders intervall för den andra experimentella och 30-minuters kontrollrör. När alla reaktioner har släckts, överför 600 mikroliter av lösning från varje reaktion på NMR-rör. För att beräkna procentkonverteringen av substrat för kontrollspektran, ladda proverna på spektrometern, samla in NMR-spektra och överlagra spektra för reglagen för noll och 30 minuter.Skala substratsignalen i zero-minute-kontrollen så att den matchar 30-minuterskontrollen och notera denna procentsats. Sedan beräknar du procentkonverteringen som 100 minus procenten från matchningen av substratsignalerna. För att beräkna underlagets procentuella omvandling för de reaktioner som innehåller testföreningen, överlagra spektra för zero-minute-kontrollen och den första reaktionen som innehåller testföreningen 500-mikromolar och skalar substratsignalen i nollminuterskontrollen så att den överensstämmer med spektrumet med testföreningen.Observera denna procentsats, och använd den för att beräkna procentkonverteringen som just visats. Därefter överlagrar du spektra för zero-minute-kontrollen och den första reaktionen som innehåller testblandningen 250 mikromolar, och skalar substratsignalen i zero-minute-kontrollen så att den matchar spektrumet med testföreningen. När du har notera procentsatsen använder du den för att beräkna procentkonverteringen.För att beräkna procentreaktionen och procentshämningen för varje testföreningskoncentration, först, beräkna procentreaktionen som procentkonverteringen av testföreningen, dividerat med procentkonverteringen av kontrolltiderna 100. Beräkna sedan procenthämningen som 100 minus procentreaktionen. För att utföra en tvättmedelsräknares analys, tillsätt 300 mikroliter av deuteriumoxid och 25 mikroliter enzymlösning till ett 15-milliliterrör som innehåller 2,59 milliliter reaktionsbuffert.Försiktigt invertera röret två gånger för att blanda reaktions stamlösningen, och tillsätt två mikroliter av Triton X-100 rengöringsmedel till 20 milliliter reaktionsbuffert. Tillsätt sedan 2,59 milliliter reaktionsbuffert, innehållande 0,01%Triton X-100-tvättmedel till ett nytt koniskt rör på 15 milliliter. Tillsätt sedan 300 mikroliter av deuteriumoxid och 25 mikroliter av enzymlösning till röret.Invertera försiktigt röret två gånger för att blanda reaktions stamlösning. Sedan, bestämma procenthämning för 100-mikromolar och 50-mikromolar testföreningar som bara visat. Använda reaktions stamlösningen utan rengöringsmedel, för en uppsättning av fyra rör och reaktionsbeståndslösningen med rengöringsmedel för en andra uppsättning av fyra rör.För att utföra en jump-dilution överför du 468 mikroliter reaktionsbuffert och 60 mikroliter av deuteriumoxid till ett rör som innehåller 53,8 mikroliter reaktionsbuffert, fem mikroliter av enzymlösning och 1,2 mikroliter DMSO som har inkuberat i 30 minuter. Aspirera och dosera blandningen två gånger på ett långsamt, men medvetet sätt. Innan 468 mikroliter av reaktionsbuffert och 60 mikroliter av deuteriumoxid överförs till ett rör som innehåller 53,8 mikroliter reaktionsbuffert, fem mikroliter enzymlösning och 1,2 mikroliter av testförening som har inkuberat i 30 minuter.Blanda den andra reaktionen två gånger som visat. Och omedelbart överföra 588 mikroliter av lösning från hoppa-utspädning DMSO kontrollröret till ett rör som innehåller 12 mikroliter av substrat med blandning. Fortsätt att överföra 588 mikroliter från jump-dilution testföreningsröret, det outspädda DMSO-kontrollröret, och det outspädda provföreningsröret till vart och ett av tre 1,5-milliliterrör, som innehåller 12 mikroliter substrat per rör med blandning med 30-sekunders intervall därefter.Vänta sedan 30 minuter innan du släcker reaktionerna, samlar in NMR-spektra och beräknar procenthämningen för varje förening som just visats. Här resultaten för att testa två föreningar mot AgNH i en inledande testförening analys med hjälp av proton NMR som påvisas visas. Enzymreaktionen observeras och kvantifieras lättsett genom att adenosinansonare och doublet-resonanser försvann vid 8,48 respektive 6,09 delar per miljon.Och utseendet på en adenin singlet bostad på 8,33 delar per miljon som observerats i 30-minuters kontrollspektrum. I denna figur visas resultaten för testning av en förening vid två koncentrationer mot AgNH i en tvättmedels mot-skärm-analys med hjälp av proton-NMR som påvisas. Endast minimala skillnader observeras i substratets och produktsignalers intensiteter med hjälp av de två villkoren, vilket indikerar att den observerade enzymhämningen inte är en artefakt av sammansatt aggregering.Observera att resonanser som uppstår från den testade föreningen och tvättmedlet inte stör substratet eller produktens resonanser. Resultaten för att testa en förening i en hoppa-utspädningsanalys mot AGNH med proton-NMR som visats avslöjar en minskad intensitet av substratsignalen i 20-mikromolarreaktionen jämfört med 200-mikromolarreaktionen, vilket indikerar att hämningen är reversibel. En fullständig provblandning under inledandet av varje reaktion och för hopputspädningarna är kritisk.En noggrann och konsekvent strävan och dispensering krävs. NMR-baserade analyser kan också användas för att mäta enzymaktiviteten i hela celler, med hjälp av en lösning som innehåller suspenderade celler i stället för reaktionsbufferten och enzymet. Vår anti-trichomonal drog upptäckt insatser fortsätter att förlita sig på dessa analyser för att mäta styrkan av nyligen syntetiserade föreningar mot ribohydrolasenzymer.Även om den används i endast mycket små mängder är den saltsyra som används för att släcka reaktionerna farlig och bör användas med rätt personlig skyddsutrustning.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Steady-state, Pre-steady-state, och Single-omsättningen Kinetic Mätning för DNA-glykosylas aktivitet

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Bestämma isbindande plan för frostskyddsproteiner genom fluorescensbaserad isplanstillhörighet

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nukleosidtrifosfaterna - Genom syntes till Biochemical karakterisering

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Fluorescens-baserad övervakning av PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens Substrat Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

En kolorimetrisk analys som Specifikt Åtgärder Granzyme B Proteolytisk Aktivitet: Hydrolys av Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deacetylering Analyser att riva upp samspelet mellan Sirtuins (SIRT2) och specifikt protein-substrat

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterisering, kvantifiering och förening specifik isotopanalys av Pyrogen Carbon användning av bensen polykarboxylsyror (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC-baserad analys för att övervaka Extracellulär Nukleotid / Nukleosid metabolism i mänskliga kronisk lymfatisk leukemi celler

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium<em&gt; N</em&gt; -Heterocykliska karbinkomplex: Syntes från bensimidazoliumsalt och katalytisk aktivitet i kol-kol-bindningsbildande reaktioner

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Samtidig mätning av HDAC1 och HDAC6 aktivitet i HeLa celler använder UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...