Name: nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases
Uploaded: 2019-06-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

Biz AGNH ve UNH enzimleri sağlamak için AstraZeneca parça Kütüphanesi ve Dr David Parkin bileşikleri sağlayan Dr Dean Brown teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüsü alerji ve bulaşıcı hastalıklar tarafından R15AI128585 ödül numarası altında, B. J. S. tarafından destekleniyordu. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüsü 'nün resmi görüşlerini temsil etmiyor. Research de bir Horace G. McDonell yaz araştırma bursu tarafından destekleniyordu S. N. M., bir Landesberg ailesi ile ödüllendirildi Kardeşlik, Adelphi Üniversitesi 'nden B. J. S. ' ye J. A. G. ve fakülte kalkınma hibe ve Frederick Bettelheim Araştırma Ödülü 'nü verdi.

1.500 μM ve 250 μM ' de ilk test bileşiği tespit edildi
<ol><li>Reaksiyonları için substrat ve test bileşiği hazırlayın.<ol>
<li>Su içinde alt substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) ve 50 mM test bileşiği dökerli dimetil sülfoxid (DMSO) stok çözümleri hazırlayın. Kullanım substrat çözeltisi konsantrasyonları için giriş bölümüne bakın.</li>
		<li>12 μL substrat (adenozin veya 5-fluorouridine) her dört 1,5 mL mikrofuge tüpler, 1-4 ekleyin.</li>
		<li>6 μL 'i 1 (0 dk. kontrol) ve 4 (30 ...

<ol>
	<li>Jardetzky, O., Roberts, G. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NMR in Molecular Biology. , (1981).</li><li>Evans, J. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular NMR spectroscopy. , (1995).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+NMR+method+for+rapid,+efficient,+and+reliable+biochemical+screening.">A general NMR method for rapid, efficient, and reliable biochemical screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 125, 14620-14625 (2003).</li><li>Dalvit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-+and+substrate-based+19F+NMR+screening:+Principles+and+applications+to+drug+discovery.">Ligand- and substrate-based 19F NMR screening: Principles and applications to drug discovery.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 51, 243-271 (2007).</li><li>Stockman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+allosteric+PIF-pocket+ligands+for+PDK1+using+NMR-based+fragment+screening+and+1H-15N+TROSY+experiments.">Identification of allosteric PIF-pocket ligands for PDK1 using NMR-based fragment screening and 1H-15N TROSY experiments.</a> Chemical Biology &amp; Drug Design. 73, 179-188 (2009).</li><li>Hirt, R. P., Sherrard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trichomonas+vaginalis+origins,+molecular+pathobiology+and+clinical+considerations.">Trichomonas vaginalis origins, molecular pathobiology and clinical considerations.</a> Current Opinion in Infectious Diseases. 28, 72-79 (2015).</li><li>Conrad, M. D., Bradic, M., Warring, S. D., Gorman, A. W., Carlton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+trichy:+Tools+and+approaches+to+interrogating+Trichomonas+vaginalis+in+a+post-genome+world.">Getting trichy: Tools and approaches to interrogating Trichomonas vaginalis in a post-genome world.</a> Trends in Parasitology. 29 (2013), 17-25 (2013).</li><li>Vers&#233;es, W., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalysis+by+nucleoside+hydrolases.">Catalysis by nucleoside hydrolases.</a> Current Opinion in Structural Biology. 13, 731-738 (2003).</li><li>Shea, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proton-pump+inhibitor+drugs+that+inhibit+Trichomonas+vaginalis+uridine+nucleoside+ribohydrolase.">Identification of proton-pump inhibitor drugs that inhibit Trichomonas vaginalis uridine nucleoside ribohydrolase.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 24, 1080-1084 (2014).</li><li>Beck, S., Muellers, S. N., Benzie, A. L., Parkin, D. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase+is+a+distinct,+druggable+antitrichomonal+target.">Adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase is a distinct, druggable antitrichomonal target.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters. 25, 5036-5039 (2015).</li><li>Muellers, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-efficient+inhibitors+of+Trichomonas+vaginalis+adenosine/guanosine+preferring+nucleoside+ribohydrolase.">Ligand-efficient inhibitors of Trichomonas vaginalis adenosine/guanosine preferring nucleoside ribohydrolase.</a> ACS Infectious Diseases. 5, 345-352 (2019).</li><li>Veronesi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorine+nuclear+magnetic+resonance-based+assay+in+living+mammalian+cells.">Fluorine nuclear magnetic resonance-based assay in living mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 495, 52-59 (2016).</li><li>Holzgrabe, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+NMR+spectroscopy+in+pharmaceutical+applications.">Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 57, 229-240 (2010).</li><li>Bharti, S. K., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+1H+NMR+spectroscopy.">Quantitative 1H NMR spectroscopy.</a> Trends in Analytical Chemistry. 35, 5-26 (2012).</li><li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+improvement+in+19F+NMR-based+screening+experiments:+Theoretical+considerations+and+experimental+applications.">Sensitivity improvement in 19F NMR-based screening experiments: Theoretical considerations and experimental applications.</a> Journal of the American Chemical Society. 127, 13380-13385 (2005).</li><li>Lambruschini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragment-based+n-FABS+NMR+screening+applied+to+the+membrane+enzyme+FAAH.">Development of fragment-based n-FABS NMR screening applied to the membrane enzyme FAAH.</a> ChemBioChem. 14, 1611-1619 (2013).</li><li>Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Fluoro-ATP+as+a+versatile+tool+for+19F+NMR-based+activity+screening.">2-Fluoro-ATP as a versatile tool for 19F NMR-based activity screening.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5870-5871 (2008).</li><li>Aldrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecstasy+and+agony+of+assay+interference+compounds.">The ecstasy and agony of assay interference compounds.</a> ACS Central Science. 3, 143-147 (2017).</li><li>Feng, B. Y., Shoichet, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+detergent-based+assay+for+the+detection+of+promiscuous+inhibitors.">A detergent-based assay for the detection of promiscuous inhibitors.</a> Nature Protocols. 1, 550-553 (2006).</li><li>Copeland, R. A., Basavapathruni, A., Moyer, M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+enzyme+concentration+and+residence+time+on+apparent+activity+recovery+in+jump+dilution+analysis.">Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis.</a> Analytical Biochemistry. , 206-210 (2011).</li><li>Griveta, J. -. P., Delort, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+for+microbiology:+In+vivo+and+in+situ+applications.">NMR for microbiology: In vivo and in situ applications.</a> Progress in NMR Spectroscopy. 54, 1-53 (2009).</li><li>Nijman, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+to+uncover+drug+mechanism+of+action.">Functional genomics to uncover drug mechanism of action.</a> Nature Chemical Biology. 11, 942-948 (2015).</li></ol>

Açıklanan protokoller genellikle birçok enzimler için geçerlidir, substratlar ve/veya ürünlerin NMR spektrumunda çözülebilir sinyaller olması koşuluyla. Ancak, substrat konsantrasyonu Km değerine yakın ve makul bir zaman dilimi içinde bir NMR deneyi tespit edilecek kadar yüksek önemlidir. 2-3x ' den yüksek olmayan bir substrat konsantrasyonu, Km değeri rekabetçi, rekabetçi olmayan ve rekabetçi olmayan inhibitörler4' ü algılamak için...

Atom manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, enzim reaksiyonları1,2olarak karakterize etmek ve izlemek için iyi kurulmuştur. Kimyasal vardiya ve kavrama desenleri farklılıkları substrat ve ürün rezonansları ayırt etmek için kullanılır, ve bağıl rezonans yoğunlukları reaksiyon yüzdesini ölçmek için kullanılır. Hem substrat tüketimi hem de ürünün oluşturulması NMR spektrumunda doğrudan görülmektedir. Bu spektrofotometri veya floresans spektroskopisi ile karşıtlık, hangi reaksiyon süresi ders tüketilen veya oluşturulan bazı kimyasal türler için atflama emilebilir bir değişiklik ile belirtilir. Diğer yöntemlerle olduğu gibi, NMR sıcaklık, pH veya diğer çözüm koşullarının bir fonksiyonu olarak enzim reaksiyonları incelemek için kullanılabilir ve inhibitörlerin etkileri tespit edilebilir.
Daha yakın zamanda, NMR tabanlı enzim aktivitesi, parça taraması3,4için gösterildi. NMR tabanlı testler, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda (genellikle 1 mM kadar yüksek) çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu, Okunma parazitlerinin sıklıkla çakışan UV-Vis emilim profilleriyle bileşiklerden ortaya çıktığı spektrofotometrik analizlere olumlu bir şekilde göre karşılaştırılır. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu avantaj onları ortogonal olarak yararlı kılar, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve üst düzey kriterlere göre değerlendirme5.
Araştırma laboratuarımızda, NMR tabanlı aktivite teşhis ve Trichomonas vaginalis nükvoyan ribohydrolases inhibitörleri değerlendirmek için kullanılır. T. vaginalis paraziti en yaygın olmayan viral cinsel yolla bulaşan hastalık6neden olur. Mevcut terapilere direnç artırma7 , ana hedefleri temsil eden temel nükle kurtarma yolu enzimleri ile, yeni, mekanizma tabanlı tedaviler için ihtiyaç sürüş olduğunu8. NMR tabanlı aktivite her iki pyrimidine-ve purine özgü enzimler için geliştirilmiştir, üridin nükl tarafı ribohydrolase (Unh)9, ve adenozin/guanozin tercih nükvanoside ribohidolaz (agnh)10. Bu iki enzim tarafından katalizlenmiş reaksiyonlar Şekil 1' de gösterilir. NMR asdiyor kimyasal başlangıç noktaları için parça kitaplıkları ekran için kullanılan, ıC50 değerlerini belirlemek, ve ot dışarı toplama tabanlı veya kovalent bağlama inhibitörleri11. Aynı Ayrıca tüm hücrelerde enzim etkinliğini değerlendirmek için tercüme ediliyor12.
500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlenen ve NMR spektroskopisi tarafından ayırt edilebilir herhangi bir enzim için geçerlidir. Basitlik için üç varsayım yapılmıştır. İlk olarak, substrat belirtilmedi. NMR tabanlı aktivite için yararlı olması için, substrat son konsantrasyonu 2-3x Km değeri4daha fazla olmalıdır. Gösterilen örneklerde, son Adenozin ve 5-fluorouridin konsantrasyonları sırasıyla 100 μM (km = 54 μM) ve 50 μm (km = 15 μm) ' dir. Protokollerde, bu konsantrasyonlar elde 12 μL 5 mM adenozin veya 12 μL 2,5 mM 5-fluorouridine karşılık gelir.
Ikinci olarak, protokollerde sağlanan enzim miktarı, 5 μL, yaklaşık% 75 oranında substrat ürüne 30 dakika içinde dönüşmesine neden olmak için gereken miktara karşılık seçildi. Bu miktar genellikle bir arıtılmış enzim stoktaki büyük bir seyreltme temsil eder ve seyreltme her enzim için önceden belirlenmelidir. Saflaştırılmış agnh ve Unh enzim stok çözümleri, birkaç bin reaksiyon için yeterli enzim sağlayan plakaya-80 °c ' de saklanır. Böylece, seyreltme faktörü ideal olarak sadece her birkaç ayda bir belirlenmeli veya doğrulanmalıdır. Üçüncü olarak, belirli 1D NMR deneyi belirtilmemiş. Temsili sonuçlarında, 1h NMR agnh10 ve 19F NMR için gösterilen Unh9için gösterilir, NMR deneyi ile ilgili referanslar açıklanmıştır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır. Son olarak, tarif edilen deneysel yaklaşımın nicel NMR (qnmr)13,14' ün sıkı gereksinimlerine uymaz olduğunu belirtmelidir. Protokolde, yüzde reaksiyon, mutlak konsantrasyonları belirlemekten ziyade, her spektrumdaki aynı rezonansın yoğunluğunda göreli değişiklikler kullanılarak belirlenir. Bu yaklaşım, qNMR için gerekli olan iç veya dış standartların yanı sıra veri edinme ve işleme değişikliklerinin de gereksinimini ortadan kaldırır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:825px;" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AGNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td style="width:215px;">TVAG_213720</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">UNH</td>
			<td style="width:180px;">Purified in-house</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>TVAG_092730</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Adenosine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">A9251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">5-Fluorouridine</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">F5130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethyl sulfoxide-D6</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-10-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Deuterium oxide</td>
			<td style="width:180px;">Cambridge Isotope Labs</td>
			<td style="width:180px;">DLM-4-100</td>
			<td>D, 99.9%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:180px;">A144212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">3-(Trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3,-d4 acid sodium salt (TSP)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">269913</td>
			<td>D, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">2,2,2-Trifluoroethanol-1,1-d2</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;">612197</td>
			<td>D, 99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123602</td>
			<td>PIPETMAN Classic P1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123601</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Pipette</td>
			<td style="width:180px;">Gilson</td>
			<td style="width:180px;">F123600</td>
			<td style="width:215px;">PIPETMAN Classic P20</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfuge tubes</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Conical tubes</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:180px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:180px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:180px;">5418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:180px;">02215365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR tubes</td>
			<td style="width:180px;">Norell</td>
			<td style="width:180px;">502-7</td>
			<td>Or as appropriate for the NMR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR spectrometer</td>
			<td style="width:180px;">Bruker</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>AvanceIII500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Prism software</td>
			<td style="width:180px;">GraphPad</td>
			<td style="width:180px;">N/A</td>
			<td>Version 5.04</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nmr-based activity assays for determining compound inhibition, ic50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases

NMR spektroskopisi, özellikle parça taraması bağlamında ilaç keşfinde enzim inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için kullanılır. NMR tabanlı aktivite, bu zayıf inhibitörleri tespit etmek için gerekli olan test bileşiklerinin daha yüksek konsantrasyonlarda çalışmak için idealdir. NMR deneyinde Dinamik Aralık ve kimyasal vardiya dağılımı, substrat, ürün ve test bileşiklerinin rezonansları kolayca çözebilir. Bu spektrofotometrik analizlerle tezat, hangi okuma-Out parazit sorunları genellikle çakışan UV-Vis emilim profilleri ile bileşiklerin ortaya çıkar. Buna ek olarak, onlar muhabir enzimleri eksikliği beri, tek enzim NMR asdiyor birleşme eğilimli değildir-assay yanlış pozitif. Bu nitelik onları ortogonal olarak yararlı hale getirir, geleneksel yüksek verimlilik taramaları tamamlayan ve en iyi değerlendirme kriterleri tamamlar. 500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik bilgi için ayrıntılı protokoller sağlanır, ıC50 değerleri, deterjan sayaç ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı, ve E. coli tüm hücrelerde de saptanması için doz-yanıtı sağlar. Yöntemler iki nükribohidolaz enzimleri kullanılarak gösterilmiştir. 1H NMR kullanımı purine özgü enzim için gösterilir, 19F NMR pyrimidine özgü enzim için gösterilir iken. Protokoller genellikle substrat ve ürün rezonansları gözlemlenebilir ve NMR spektroskopisi ile ayırt edilen herhangi bir enzim için geçerlidir. İlaç keşfi bağlamında en yararlı olmak için, substrat son konsantrasyonu 2-3x onun Km değeri daha fazla olmalıdır. NMR deneyi seçimi, mevcut NMR enstrümantasyon yanı sıra enzim reaksiyonu ve substratlar bağlıdır.

Şekil 2 , 1H NMR aşağıdaki bölüm 1 ' i kullanarak agnh 'ye karşı iki bileşiği test etme sonuçlarını gösterir. Enzim reaksiyonu en kolay gözlenen ve 8,48 ppm ve 6,09 ppm, sırasıyla adenozin atlet ve Doublet rezonansları ortadan kaybolması ile nicelik, ve bir adenin atlet rezonans görünüm içinde 8,33 ppm olarak gözlenen 30 dk kontrol Spektrum. 500 μM bileşiği 1 ' in varlığında, 8,33 ppm 'de bir adenin rezonans eksikliği tarafından kanıtlandığı gib...

Watch this Scientific Journal Video about NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases at JoVE

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

NMR tabanlı aktivite, iki nükle ribohidolaz enzimin inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için geliştirilmiştir. 500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik olarak yapılan protokoller, ıC50 değerlerinin belirlenmesi, deterjan sayacı ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı ve E. coli tüm hücrelerde saptanması için doz-yanıtı sağlar.

NMR spectroscopy is often used for the identification and characterization of enzyme inhibitors in drug discovery, particularly in the context of fragment ...

NMR tabanlı aktivite tahlilleri, belirli bir enzim için inhibitörleri tanımlamak, değerlendirmek ve doğrulamak için etkili bir yöntem sağlar. Özellikle parça taraması için çok uygundurlar. NMR tahlilleri zayıf inhibitörler için gerekli yüksek bileşik konsantrasyonları için münasiptir.Buna ek olarak, muhabir enzimlerin eksikliği onları yanlış pozitiflere daha az yatkın hale getirir. Trichomonas vaginalis'ten iki enzimin inhibitörlerini belirlemek ve karakterize etmek için laboratuarımızda NMR tahlillerini kullanıyoruz. Her iki enzim de yeni anti-tritrihomonal ilaçlar için yeni hedefler temsil eder.NMR tahlilleri genellikle enzimleri içeren herhangi bir araştırma alanı için geçerlidir, ve hatta hücrelerin içindeki enzimleri incelemek için kullanılabilir. Tekniğin en önemli yönleri, doğru reaktif hacimlerinin boruya aktarılmasını ve reaksiyon bileşenlerinin iyice karıştırılmasını sağlamaktır. Substrat ve test bileşiklerini hazırlamak için, dört adet 1,5 mililitrelik mikrofuge tüpün her birine 12 mikrolitre substrat ekleyin ve sıfır dakikalık kontrol ve 30 dakikalık kontrol tüplerine altı mikrolitre deuterated DMSO ekleyin.İlk deney tüpüne altı mikrolitre test bileşiği, test bileşiğinin üç mikrolitresi ve ikinci deney tüpüne üç mikrolitre deuterated DMSO ekleyin. Daha sonra, 2.59 mililitre reaksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe 300 mikrolitre döteryum oksit ekleyin ve ardından 25 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin. Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez ters çevirin ve 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe 1,5 molar hidroklorik asit 10 mikrolitre ekleyin.Daha sonra, reaksiyon stok çözeltisi ve asit hacminin tamamını sıfır dakikalık kontrol tüpüne aktararak sıfır dakikalık kontrol reaksiyonu başlatın ve söndürün. Numuneyi yavaş ama kasıtlı bir şekilde iki kez azarlama ve dağıtma. Geri kalan üç reaksiyonu şaşırtıcı bir şekilde başlatın ve çalıştırın, reaksiyon stok çözeltisinin 582 mikrolitresini ilk deneysel tüpe hemen aktarın ve numuneyi sadece gösterildiği gibi iki kez karıştırın.Dikkatli bir aspirasyon ve dağıtım başlatma adımları sırasında tam bir karıştırma sağlar. Diferansiyel karıştırmanın bir değişken olmadığından emin olmak için her örnekle tutarlı olun. 30 saniye sonra, 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisini ikinci deney tüpüne aktarın ve karıştırın, ardından ikinci deney tüpünde reaksiyonu başlattıktan 30 saniye sonra 30 dakikalık kontrol tüpüne 582 mikrolitre reaksiyon stok çözeltisi ilave edin.30 dakika sonra, ilk deney tüpüne 10 mikrolitre 1,5 molar hidroklorik asit ekleyin, ikinci deney ve 30 dakikalık kontrol tüpleri için 30 saniyelik aralıklarla söndürmetekrar. Tüm reaksiyonlar söndürüldüğünde, her reaksiyondan 600 mikrolitre çözeltiyi NMR tüplerine aktarın. Kontrol spektrumu için substrat yüzde dönüşüm hesaplamak için, spektrometre üzerine örnekleri yükleyin, NMR spektrumları toplamak ve sıfır ve 30 dakikalık kontroller için spektrum bindirme.30 dakikalık denetimle eşleşecek şekilde sıfır dakikalık denetimdeki substrat sinyalini ölçeklendirin ve bu yüzdeye dikkat edin. Ardından, yüzde dönüşümünü substrat sinyallerinin eşleştirilmesinden 100 eksi olarak hesaplayın. Test bileşiği içeren reaksiyonlar için substrat yüzde dönüşüm hesaplamak için, sıfır dakika kontrolü ve 500 mikromolar test bileşiği içeren ilk reaksiyon için spektrum bindirme ve test bileşiği ile spektrum maç için sıfır dakika kontrolü nde substrat sinyali ölçeklendirmek.Bu yüzdeyi not edin ve az önce gösterildiği gibi yüzde dönüşümünü hesaplamak için kullanın. Daha sonra, sıfır dakikalık kontrol ve 250 mikromolar test bileşiği içeren ilk reaksiyon için spektrumu yeraltın ve test bileşiği ile spektrumu eşleştirmek için sıfır dakikalık kontrolde substrat sinyalini ölçeklendirin. Yüzdeyi kaydettikten sonra, yüzde dönüşümünü hesaplamak için kullanın.Her test bileşik konsantrasyonu için yüzde reaksiyon ve yüzde inhibisyonu hesaplamak için, ilk olarak, test bileşik yüzde dönüşüm olarak yüzde reaksiyon hesaplamak, kontrol süreleri 100 yüzde dönüşüm bölünür. Sonra yüzde inhibisyonu yüzde 100 eksi reaksiyon olarak hesaplayın. Bir deterjan karşı teşrisi yapmak için, 2,59 mililitre reaksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe 300 mikrolitre döteryum oksit ve 25 mikrolitre enzim çözeltisi ekleyin.Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez hafifçe ters çevirin ve 20 mililitre reaksiyon tamponuna iki mikrolitre Triton X-100 deterjan ekleyin. Daha sonra, yeni bir 15 mililitre konik tüp için% 0.01 Triton X-100 deterjan içeren reaksiyon tampon 2.59 mililitre ekleyin. Sonra tüp için döteryum oksit 300 mikrolitre ve enzim çözeltisi 25 mikrolitre ekleyin.Reaksiyon stok çözeltisini karıştırmak için tüpü iki kez hafifçe ters çevirin. Daha sonra, 100 mikromolar ve 50-mikromolar test bileşikleri için yüzde inhibisyonu belirlemek gibi sadece gösterdi. Reaksiyon stok çözeltisi deterjan olmadan kullanarak, dört tüpler bir set ve dört tüpler ikinci bir set için deterjan ile reaksiyon stok çözeltisi.Bir sıçrama seyreltme gerçekleştirmek için, reaksiyon tampon 468 mikrolitre ve reaksiyon tampon 53,8 mikrolitre reaksiyon tampon, enzim çözeltisi beş mikrolitre ve 30 dakika boyunca kuluçka olmuştur DMSO 1,2 mikrolitre içeren bir tüp döteryum oksit 60 mikrolitre aktarın. Aspirat ve yavaş, ama kasıtlı bir şekilde karışımı iki kez dağıtmak. Reaksiyon tampon468 mikrolitre ve döteryum oksit 60 mikrolitre bir tüp içeren bir tüp transfer etmeden önce 53.8 reaksiyon tampon, enzim çözeltisi beş mikrolitre, ve test bileşik 1.2 mikrolitre 30 dakika kuluçka olmuştur.İkinci reaksiyonu gösterildiği gibi iki kez karıştırın. Ve hemen 588 mikrolitre çözeltiyi sıçrama seyreltme DMSO kontrol tüpünden 12 mikrolitre substrat içeren bir tüpe ve karıştırmaya aktarın. Jump-dilution test bileşik tüpünden 588 mikrolitre aktarmaya devam edin, seyreltilmemiş DMSO kontrol tüpü ve seyreltilmemiş test bileşik tüpü üç adet 1,5 mililitrelik tüplerin her birine, tüp başına 12 mikrolitre substrat içeren ve bundan sonra 30 saniyelik aralıklarla karıştırılarak.Daha sonra reaksiyonları söndürmeden önce 30 dakika bekleyin, NMR spektrumlarını toplayın ve her bileşik için az önce gösterildiği gibi yüzde inhibisyonu hesaplayın. Burada proton NMR kullanılarak yapılan ilk test bileşimi testinde AgNH'ye karşı iki bileşiğitest etme sonuçları gösterilmiştir. Enzim reaksiyonu en kolay gözlenir ve sırasıyla milyon da 8.48 ve 6.09 parça adenozin singlet ve doublet rezonansların kaybolması ile ölçülür.Ve 30 dakikalık kontrol spektrumunda gözlendiği gibi milyonda 8.33'lük bir adenin bekar rezidansın görünümü. Bu şekilde, proton NMR kullanılarak agnh karşı iki konsantrasyonda bir bileşiğin test sonuçları gösterilmiştir. Gözlemlenen enzim inhibisyonunun bileşik agregasyon un bir artifakı olmadığını gösteren, iki koşul kullanılarak substrat ve ürün sinyallerinin yoğunluklarında sadece minimal farklılıklar gözlenir.Test edilen bileşik ten ve deterjandan kaynaklanan rezonansların substrat veya ürün rezonanslarına müdahale etmediğini unutmayın. Proton NMR kullanılarak AGNH'ye karşı bir bileşim test etme sonuçları, 20mikromolar reaksiyona göre 20 mikromolar reaksiyonda substrat sinyalinin yoğunluğunun azaldığını ortaya çıkararak inhibisyonun geri döndürülebilir olduğunu göstermektedir. Her reaksiyonun başlatılması sırasında ve sıçrama seyreltmeleri için tam bir numune karıştırma sı önemlidir.Dikkatli ve tutarlı bir aspirasyon ve dağıtım gereklidir. NMR tabanlı tahliller de reaksiyon tampon ve enzim yerine askıya hücreleri içeren bir çözüm kullanarak, tüm hücrelerde enzim aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Anti-trikünal ilaç keşif çabalarımız, yeni sentezlenen bileşiklerin ribohidrolaz enzimlerine karşı gücünü ölçmek için bu tahlillere dayanmaya devam etmektedir.Sadece çok küçük miktarlarda kullanılmasına rağmen, reaksiyonları söndürmek için kullanılan hidroklorik asit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanile kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Chemistry

NMR-Based Activity Assays for Determining Compound Inhibition, IC50 Values, Artifactual Activity, and Whole-Cell Activity of Nucleoside Ribohydrolases

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Floresan Bazlı Buz Düzlemi Benzeşimi ile Antifriz Proteinlerinin Buz Bağlayıcı Düzlemlerinin Belirlenmesi

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

Nükleosid trifosfatlar - sentezinden Biyokimyasal Karakterizasyonu için

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan&#39;a bağlı İzleme

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

Deasilasyon Tahliller Sirtuins arasında karşılıklı etkileşim (SIRT2) ve Özgül Protein yüzeylerde Unravel için

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids (BPCA)

Characterization, Quantification and Compound-specific Isotopic Analysis of Pyrogenic Carbon Using Benzene Polycarboxylic Acids BPCA

Karakterizasyon, benzen polikarboksilik asitler kullanılarak Pirojenik karbon miktarının ve Bileşik özgü izotopik Analizi (BPCA)

Fire-derived, pyrogenic carbon (PyC), sometimes called black carbon (BC), is the carbonaceous solid residue of biomass and fossil fuel combustion, such as ...

HPLC-based Assay to Monitor Extracellular Nucleotide/Nucleoside Metabolism in Human Chronic Lymphocytic Leukemia Cells

HPLC tabanlı Testi İnsan Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinde Ekstraselüler Nükleotid / Nükleozid Metabolizması Monitör

This method describes a sensitive, specific, reliable and reproducible reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) assay developed and ...

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

Palladium N-Heterocyclic Carbene Complexes: Synthesis from Benzimidazolium Salts and Catalytic Activity in Carbon-carbon Bond-forming Reactions

palladyum<em&gt; K</em&gt; -Heterosiklik Karben Kompleksleri: Benzimidazolyum Tuzlarından Sentez ve Karbon-karbon Bağ Oluşturma Reaksiyonlarında Katalitik Aktivite

Detailed and generalized protocols are presented for the synthesis and subsequent purification of four palladium N-heterocyclic carbene complexes from ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...