我们开发了一种简单的方法来测试不同C perfringens毒素类型的食品样品。我们特别感兴趣的毒素类型B和D的流行率，产生埃普西隆毒素。我们的协议允许轻松浓缩和检测各种C perfringens毒素型，而无需使用厌氧室或培养箱与有限的亚培养。
此方法还可用于测试土壤、水、粪便样本等。演示这个程序的将是祖哈·安瓦尔和萨曼莎·里根，来自实验室的技术人员。首先准备修改后的快速飞向介质或 RPM。
根据手稿方向组合成分，在 121 摄氏度下将混合物冷却 15 分钟。让介质冷却到大约 40 摄氏度，然后将 D-环素加入到每升 440 毫克的最终浓度中。无菌地将 RPM 转移到 15 毫升锥形管，并在 4 摄氏度下储存长达一个月。
使用前，将中温温度加热至37摄氏度。收集要测试的样品时，请根据手稿指示将食物转移到实验室。如果不立即测试，食物可以储存在零下20摄氏度。
记下食品类型和产地，以及任何其他相关信息。要测试食物，将大约一到两克转移到无菌培养皿中，然后用无菌剃刀刀片或手术刀细细切碎。在15毫升锥形管中将PBS接种到10毫升中，并混合良好。
通过将 5 毫升 PBS 食物混合物转移到 15 毫升锥形管中，并紧贴盖子，为植物细胞选择。通过将混合物的剩余 5 毫升加热到 85 摄氏度 15 分钟，选择孢子。然后将其转移到带 RPM 的管子上，然后紧闭盖子。
确保完全混合，涡流和反转食物RPM培养。然后，紧密密封锥形管，用石蜡膜包裹盖子，以营造一个厌氧环境。在37摄氏度下孵育管子过夜，并在第二天早上注意任何浊度或发酵。
根据制造商的方向准备三角素素或 TSC Agar，然后使用三明治技术用隔夜 RPM 培养物进行接种。通过将10毫升的熔融阿加转移到无菌的培养皿中，使其凝固，准备板的基层。将剩余的 TSC Agar 保持在 40 摄氏度的顶层，并小心地将 100 微升的隔夜 RPM 培养基转移到 Agar 基地。
某些培养物可能由于发酵而承受压力，因此请务必佩戴所有适当的个人防护设备。用无菌玻璃珠或细胞传播器传播注射素，让RPM吸收到阿加中5至10分钟。然后，使用血清移液器小心地将 20 毫升熔融 TSC Agar 转移到板中。
更换Petrie盘盖，让TSC Agar在室温下完全凝固，然后倒置盘，在37摄氏度下孵育过夜。如果需要，在接种 TSC Agar 之前，对 RPM 培养物进行连续稀释。孵育后，检查板的细菌生长。
有氧细菌可能存在于阿加的表面，而厌氧细菌将嵌入在阿加。硫酸盐减少细菌将变成周围的阿加黑色，可能的C perfringens菌落将是黑色和嵌入在阿加。如果板面有密集的有氧细菌生长，请使用细胞刮刀从选定区域去除菌落。
使用无菌的一次使用式滴管从 Agar 中拔出可疑的 C perfringens 菌落，确保在刺穿 Agar 之前排出空气。在 15 毫升锥形管中将菌落转移到 10 毫升新鲜 RPM。多个菌落可以从同一个板取样到单独的 RPM 培养物中。
紧密固定锥形管盖，用石蜡薄膜包裹，并在37摄氏度下孵育过夜。C perfringens 是一个 BSL 两个有机体。必须时刻使用适当的安全预防措施，尤其是在打开隔夜 RPM 培养物时，并小心地净化和处置用过的介质。
第二天，去除隔夜培养物，检查其浊度和发酵，然后进行DNA提取。轻轻反转 RPM 培养，以分散任何已结算的细菌，并小心地打开管。将一毫升转移到微离心管中，通过离心对细菌进行颗粒化。
用一毫升无菌 PBS 清洗颗粒。如果未消化的明胶已经定居在细菌的顶部，通过用PBS搅拌来甩掉它。轻轻吸气明胶和 PBS，用一毫升新鲜 PBS 重新悬浮剩余的细菌颗粒。
在细胞颗粒受到有限干扰的情况下去除任何颗粒明胶非常重要。未能去除明胶可能会抑制DNA提取和PCR。离心10分钟，小心吸上一代。
然后使用专为克阳性细菌设计的试剂盒进行DNA提取。立即使用DNA，或将其储存在零下20摄氏度。对提取的DNA执行PCR，以确定培养物是否对C perfringens毒素型呈阳性。
使用 C perfringens DNA 作为阳性对照，以确保所有 PCR 试剂正常工作。根据手稿方向运行 PCR，并分析使用阿加罗斯凝胶电泳的产品。该协议用于测试从纽约零售商店购买的总共 216 个食品样品。
样本包括各种肉类样本、家禽样本和海鲜样本。C perfringens B 型用作正控。结果发现，15-20%的抽样食品对C perfringens检测呈阳性。
在34个阳性样本中，31个样本含有α毒素，一个样本含有α、β和epxinon毒素。两个样本含有α和埃普西隆毒素。我们开发了一种简单的方法来测试不同C perfringens毒素类型的食品样品。
我们特别感兴趣的毒素类型B和D的流行率，产生埃普西隆毒素。
