18.9K Views
•
08:00 min
•
October 18th, 2019
DOI :
October 18th, 2019
•0:04
Title
0:42
Media Preparation and Sample Collection
2:48
TSC Sandwich Plating
4:05
Sub-culturing of Sulfite-Reducing Colonies
5:08
DNA Extraction and PCR Genotyping
7:29
Conclusion
Transcript
We hebben een eenvoudige methode ontwikkeld om voedselmonsters te testen op de verschillende C-toxineotypen. We zijn vooral geïnteresseerd in de prevalentie van toxineotypen B en D die het epsilontoxine produceren. Ons protocol maakt eenvoudige verrijking en detectie van de verschillende C perfringens toxinotypen zonder het gebruik van anaerobe kamers of incubators met beperkte sub-culturing.
Deze methode kan ook worden gebruikt om bodem, water, fecale monsters en meer te testen. Het aantonen van de procedure zal Zuha Anwar en Samantha Regan, technici van het lab. Begin met het voorbereiden van aangepaste snelle perfringens medium, of RPM.
Combineer ingrediënten volgens manuscriptaanwijzingen en beklad het mengsel gedurende 15 minuten bij 121 graden Celsius. Laat het medium afkoelen tot ongeveer 40 graden Celsius en voeg vervolgens D-cycloserine toe aan een uiteindelijke concentratie van 440 milligram per liter. Aseptically breng de RPM naar 15 milliliter conische buizen, en op te slaan op vier graden Celsius voor maximaal een maand.
Verwarm voor het gebruik het medium tot 37 graden Celsius. Bij het verzamelen van monsters die moeten worden getest, breng je het voedsel naar het laboratorium volgens de hand van het manuscript. Als het niet onmiddellijk wordt getest, kan het voedsel worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius.
Noteer het type voedsel en het land van herkomst, evenals alle andere relevante informatie. Om het voedsel te testen, breng ongeveer een tot twee gram over naar een steriel petrischaaltje en maak het fijn met een steriel scheermesje of scalpel. Inenting in 10 milliliter PBS in een 15 milliliter conische buis, en meng goed.
Selecteer voor vegetatieve cellen door vijf milliliter van het PBS-voedselmengsel over te brengen naar een conische buis van 15 milliliter met 10 milliliter rpm en het deksel stevig te sluiten. Selecteer voor sporen door het verwarmen van de resterende vijf milliliter van het mengsel tot 85 graden Celsius gedurende 15 minuten. En dan overbrengen naar een buis met RPM en het sluiten van het deksel strak.
Om te zorgen voor volledige mengen, vortex en omkeren van het voedsel RPM culturen. Sluit vervolgens de conische buizen goed af en wikkel de deksels met paraffinefilm om een anaerobe omgeving te creëren. Incubeer de buizen 's nachts op 37 graden Celsius en let op een troebelheid of fermentatie op de volgende ochtend.
Bereid Tryptose Sulfite Cycloserine of TSC Agar volgens de richting van de fabrikant, en gebruik vervolgens de sandwichtechniek om het te inenten met 's nachts RPM-culturen. Bereid de basislaag van de platen door het overbrengen van 10 milliliter van de gesmolten Agar naar steriele Petrie gerechten en waardoor het te stollen. Houd de resterende TSC Agar op 40 graden Celsius voor de bovenste laag, en breng zorgvuldig 100 microliters van de nachtelijke RPM-cultuur over naar de Agar-basis.
Sommige culturen kunnen onder druk staan als gevolg van fermentatie, dus zorg ervoor dat u alle geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Verdeel de entmateriaal met steriele glazen kralen of een celspreader en laat RPM gedurende vijf tot tien minuten in de Agar worden opgenomen. Gebruik vervolgens een serologische pipet om zorgvuldig 20 milliliter van de gesmolten TSC Agar op de plaat over te brengen.
Vervang de Petrie schotel deksel en laat TSC Agar volledig stollen bij kamertemperatuur, dan omkeren van de schotel en incubeer het op 37 graden Celsius 's nachts. Voer indien nodig seriële verdunningen uit van de rpm-cultuur voorafgaand aan inenting in TSC Agar. Na de incubatie, onderzoeken platen voor bacteriële groei.
Aërobe bacteriën kunnen aanwezig zijn op het oppervlak van de Agar, terwijl anaërobe bacteriën zullen worden ingebed in de Agar. Sulfiet reducerende bacteriën zal de omringende Agar zwart, en mogelijke C perfringens kolonies zal zwart zijn en ingebed in de Agar. Als er een dichte hoeveelheid aërobe bacteriële groei op het oppervlak van de plaat, gebruik dan een cel schraper om kolonies te verwijderen uit geselecteerde gebieden.
Gebruik een steriele oogdruppelaar voor eenmalig gebruik om de vermoedelijke C perfringens kolonies uit de Agar te plukken, zorg ervoor dat de lucht te verdrijven voordat de Agar wordt doorboord. Breng de kolonies over op 10 milliliter verse rpm in een 15 milliliter conische buis. Meerdere kolonies kunnen worden bemonsterd van dezelfde plaat in afzonderlijke RPM culturen.
Zet de conische buisdeksels stevig vast, wikkel ze in paraffinefilm en broed ze 's nachts uit op 37 graden Celsius. C perfringens is een BSL twee organisme. Het is belangrijk om te allen tijde de juiste veiligheidsmaatregelen te gebruiken, vooral bij het openen van rpm-culturen van de ene op de andere dag en om gebruikte media zorgvuldig te ontsmetten en te verwijderen.
Op de volgende dag, verwijder de nachtelijke culturen en onderzoeken ze voor troebelheid en fermentatie, ga dan verder met DNA-extractie. Draai voorzichtig de RPM-cultuur om om eventuele vaste bacteriën te verspreiden en de buis voorzichtig te openen. Breng een milliliter over naar een microcentrifugebuis en pellet de bacteriën door centrifugatie.
Was de pellet met een milliliter steriele PBS. Als onverteerd gelatine zich heeft gevestigd op de top van de bacteriën, pluis het af door te roeren met PBS. Voorzichtig aspirate de gelatine en PBS en opnieuw op te schorten de resterende bacteriële pellet met een milliliter verse PBS.
Het is belangrijk om een pelleted gelatine te verwijderen met beperkte verstoring van de celpellet. Het niet verwijderen van gelatine kan de extractie en PCR van DNA remmen. Centrifugeer de bacteriën gedurende 10 minuten en pireer de supernatant voorzichtig aan.
Voer vervolgens DNA-extractie uit met behulp van een kit die speciaal is ontworpen voor grampositieve bacteriën. Gebruik het DNA onmiddellijk of bewaar het op min 20 graden Celsius. Voer PCR uit op het geëxtraheerde DNA om te bepalen of de culturen positief zijn voor C perfringens toxinotypen.
Gebruik C perfringens DNA als een positieve controle om ervoor te zorgen dat alle PCR reagentia werken. Voer de PCR volgens manuscript richtingen en analyseren van de producten met agarose gel elektroforese. Dit protocol werd gebruikt om een totaal van 216 voedselmonsters gekocht bij New York winkels te testen.
Monsters opgenomen verschillende vleesmonsters, pluimvee monsters, en zeevruchten monsters. C perfringens Type B werd gebruikt als een positieve controle. Er werd vastgesteld dat 15 tot 20% van de bemonsterde voedingsmiddelen positief test voor C perfringens.
Van de 34 positieve monsters, 31 monsters bevatte de alfa toxine, een monster bevatte de alfa, beta, en epsilon toxine. En twee monsters bevatten het alfa- en epsilontoxine. We hebben een eenvoudige methode ontwikkeld om voedselmonsters te testen op de verschillende C-toxineotypen.
We zijn vooral geïnteresseerd in de prevalentie van toxineotypen B en D die het epsilontoxine produceren.
Het doel van dit protocol is het opsporen van verschillende Clostridium perfringens toxinotypes in lokaal aangekochte voedingsmiddelen, in het bijzonder Epsilon toxine die stam types B en D produceren, zonder het gebruik van anaerobe kamers.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved