פיתחנו שיטה קלה לבדיקת דגימות מזון עבור C perfringens טוקסינוטיפים שונים. אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של רעלנים B ו- D המייצרים את רעלן אפסילון. הפרוטוקול שלנו מאפשר העשרה קלה וזיהוי של רעלנים C perfringens שונים ללא שימוש בתאים אנאירוביים או אינקובטורים עם תת-culturing מוגבל.
שיטה זו יכולה לשמש גם לבדיקת אדמה, מים, דגימות צואה ועוד. הדגימו את ההליך יהיו זוהא אנואר וסמנתה ריגן, טכנאים מהמעבדה. התחל על-ידי הכנת אמצעי perfringens מהיר שונה, או סל"ד.
מערבבים את החומרים לפי הוראות כתב היד, ומקלים את התערובת ב-121 מעלות במשך 15 דקות. אפשר את המדיום להתקרר כ 40 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף D-ציקלוזרין לריכוז סופי של 440 מיליגרם לליטר. מעבירים את הסל"ד ל-15 מיליליטר צינורות חרוטיים, ומאחסנים בארבע מעלות צלזיוס עד חודש.
לפני השימוש, מחממים את המדיום ל 37 מעלות צלזיוס. בעת איסוף דגימות לבדיקה, מעבירים את המזון למעבדה בהתאם לכיווני כתב היד. אם לא בודקים מיד, ניתן לאחסן את המזון במינוס 20 מעלות צלזיוס.
שימו לב לסוג המזון ולארץ המוצא, כמו גם לכל מידע רלוונטי אחר. כדי לבדוק את המזון, להעביר כ 1-2 גרם לצלחת פטרי סטרילית, טחון דק עם סכין גילוח סטרילי או אזמל. לחסן אותו לתוך 10 מיליליטר של PBS בצינור חרוט 15 מיליליטר, ומערבבים היטב.
בחר עבור תאים צמחיים על ידי העברת חמישה מיליליטר של תערובת מזון PBS לצינור חרוט 15 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סל"ד וסגירת המכסה בחוזקה. בחר נבגים על ידי חימום חמשת המיליליטרים הנותרים של התערובת ל 85 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. ואז להעביר אותו לצינור עם סל"ד ולסגור את המכסה בחוזקה.
כדי להבטיח ערבוב מלא, מערבולת ולהפוך את תרבויות סל"ד מזון. לאחר מכן, לאטום בחוזקה את הצינורות חרוט לעטוף את העפעפיים עם סרט פרפין כדי ליצור סביבה אנאירובית. הדגירה את הצינורות לילה ב 37 מעלות צלזיוס ולציין כל ערוב או תסיסה בבוקר שלמחרת.
הכן טריפטוז סולפיט Cycloserine או TSC אגר על פי כיוון היצרן, ולאחר מכן להשתמש בטכניקת כריך כדי לחסן אותו עם תרבויות סל"ד לילה. הכן את שכבת הבסיס של הצלחות על ידי העברת 10 מיליליטר של אגר מותך מנות פטרי סטריליות ומאפשר לו לחזק. שמרו על שאר ה-TSC Agar ב-40 מעלות צלזיוס לשכבה העליונה, והעבירו בזהירות 100 מיקרוליטרים של תרבות הסל"ד הלילית לבסיס אגר.
תרבויות מסוימות עשויות להיות תחת לחץ עקב תסיסה, כדי להיות בטוח ללבוש את כל ציוד מגן אישי המתאים. מורחים את ה אינוקולין עם חרוזי זכוכית סטריליים או מפזר תאים, ולאפשר סל"ד להיספג לתוך אגר במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, השתמש פיפטה סרולוגית להעביר בזהירות 20 מיליליטר של TSC אגר מותך לצלחת.
החלף את מכסה צלחת פטרי ולאפשר TSC אגר להתגבש לחלוטין בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להפוך את המנה דגירה אותו ב 37 מעלות צלזיוס לילה. במידת הצורך, בצע דילול סדרתי של תרבות סל"ד לפני חיסון לתוך TSC אגר. לאחר הדגירה, לבדוק צלחות לצמיחה חיידקית.
חיידקים אירוביים עשויים להיות נוכחים על פני השטח של אגר, בעוד חיידקים אנאירוביים יוטבעו אגר. חיידקים מפחיתים סולפיט יהפכו את אגר הסובבת שחור, ו אפשרי C perfringens מושבות יהיה שחור מוטבע אגר. אם יש כמות צפופה של צמיחת חיידקים אירוביים על פני השטח של הצלחת, השתמש מגרד תאים כדי להסיר מושבות מאזורים נבחרים.
השתמש בטפטפת עיניים סטרילית חד-השתמשית כדי לתלוש את המושבות החשודות C perfringens מן אגר, הקפד לגרש את האוויר לפני פירסינג אגר. מעבירים את המושבות ל-10 מיליליטר של סל"ד טרי בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. ניתן לדגום מושבות מרובות מאותה לוח לתרבויות סל"ד נפרדות.
לאבטח היטב את מכסי צינור חרוט, לעטוף אותם בסרט פרפין, ו דגירה אותם לילה ב 37 מעלות צלזיוס. C perfringens הוא אורגניזם BSL 2. חשוב להשתמש באמצעי זהירות נאותים בכל עת, במיוחד בעת פתיחת תרבויות סל"ד לילה כדי לטהר בזהירות ולהיפטר מדיה משומשת.
למחרת, להסיר את תרבויות הלילה ולבחון אותם עבור חרפת ותסיסה, ולאחר מכן להמשיך עם מיצוי DNA. בעדינות להפוך את תרבות סל"ד כדי לפזר את כל החיידקים מיושבים בזהירות לפתוח את הצינור. מעבירים מיליליטר אחד לצינור מיקרוצנטריפוגה ומעבירים את החיידקים על ידי צנטריפוגה.
לשטוף את גלולה עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי. אם ג'לטין מעוכל התיישב על גבי החיידקים, להתפיג אותו על ידי תסיסה עם PBS. יש לאסוף בעדינות את הג'לטין וה-PBS ולהשעות מחדש את גלולת החיידקים הנותרת עם מיליליטר אחד של PBS טרי.
חשוב להסיר כל ג'לטין גלולה עם הפרעה מוגבלת של גלולת התא. כישלון בהסרת ג'לטין עלול לעכב מיצוי DNA ו- PCR. צנטריפוגה החיידקים במשך 10 דקות בזהירות לשאוף את supernatant.
לאחר מכן לבצע מיצוי DNA באמצעות ערכה שתוכננה במיוחד עבור חיידקים חיוביים גרם. השתמש בדנ"א באופן מיידי או אחסן אותו במינוס 20 מעלות צלזיוס. בצע PCR על ה-DNA שחולץ כדי לקבוע אם התרבויות חיוביות עבור C perfringens רעלנים.
השתמש ב- C perfringens DNA כפקד חיובי כדי להבטיח שכל חברי ההנהלה של PCR פועלים. הפעל את PCR על פי הוראות כתב יד ולנתח את המוצרים עם אלקטרופורזה ג'ל agarose. פרוטוקול זה שימש לבדיקת סך של 216 דגימות מזון שנרכשו מחנויות קמעונאיות בניו יורק.
הדגימות כללו דגימות בשר שונות, דגימות עופות ודגימות פירות ים. C perfringens סוג B שימש כפקד חיובי. נמצא כי 15 עד 20% ממזונות שנדגמו נמצאו חיוביים עבור C perfringens.
מתוך 34 הדגימות החיוביות, 31 דגימות הכילו את רעלן האלפא, מדגם אחד הכיל את רעלן אלפא, בטא ואפסילון. ושתי דגימות הכילו את רעלן האלפא והאפסילון. פיתחנו שיטה קלה לבדיקת דגימות מזון עבור C perfringens טוקסינוטיפים שונים.
אנו מעוניינים במיוחד בשכיחות של רעלנים B ו- D המייצרים את רעלן אפסילון.
