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October 18th, 2019
DOI :
October 18th, 2019
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Title
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Media Preparation and Sample Collection
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TSC Sandwich Plating
4:05
Sub-culturing of Sulfite-Reducing Colonies
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DNA Extraction and PCR Genotyping
7:29
Conclusion
Transcript
हमने विभिन्न सी परफ्रिंगन टोक्सिनोटाइप के लिए खाद्य नमूनों का परीक्षण करने के लिए एक आसान तरीका विकसित किया है। हम विशेष रूप से टॉक्सिनोटाइप बी और डी की व्यापकता में रुचि रखते हैं जो एप्सिलॉन टॉक्सिन का उत्पादन करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल सीमित उप-संस्कृति के साथ एनारोबिक कक्षों या इनक्यूबेटर के उपयोग के बिना विभिन्न सी परफ्रिंगन टोक्सिनोटाइप के आसान संवर्धन और पता लगाने की अनुमति देता है।
इस विधि का उपयोग मिट्टी, पानी, मल के नमूनों और अधिक का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन जुहा अनवर और सामंथा रेगन, प्रयोगशाला से तकनीशियनों होगा । संशोधित रैपिड पर्फ्राजेन्स माध्यम, या आरपीएम तैयार करके शुरू करें।
पांडुलिपि दिशाओं के अनुसार सामग्री को मिलाएं, और मिश्रण को 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव करें। माध्यम को लगभग 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें, फिर डी-साइक्लोसरीन को 440 मिलीग्राम प्रति लीटर की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें। असीमत आरपीएम को 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में स्थानांतरित करें, और एक महीने तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
उपयोग करने से पहले, मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। नमूनों को एकत्र करते समय जांच की जानी चाहिए, पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार भोजन को प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें। यदि तुरंत परीक्षण नहीं किया जाता है, तो भोजन को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
भोजन के प्रकार और मूल देश, साथ ही किसी भी अन्य प्रासंगिक जानकारी का ध्यान रखें। भोजन का परीक्षण करने के लिए, लगभग एक से दो ग्राम को बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और इसे बाँझ रेजर ब्लेड या स्केलपेल के साथ बारीक कीमा करें। इसे 15 मिलीलीटर शंकु नली में पीबीएस के 10 मिलीलीटर में टीका लगाएं, और अच्छी तरह से मिलाएं।
पीबीएस खाद्य मिश्रण के पांच मिलीलीटर को आरपीएम के 10 मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करके वनस्पति कोशिकाओं के लिए चुनें और ढक्कन को कसकर बंद करें। मिश्रण के शेष पांच मिलीलीटर को 15 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके बीजाणुओं के लिए चुनें। और फिर इसे आरपीएम के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित करना और ढक्कन को कसकर बंद करना।
पूर्ण मिश्रण, भंवर सुनिश्चित करने और भोजन आरपीएम संस्कृतियों उलटा करने के लिए। फिर, शंकुपाली ट्यूबों को कसकर सील करें और एक अवायवीय वातावरण बनाने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन लपेटें। ट्यूबों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और अगले सुबह किसी भी टर्बिडिटी या किण्वन पर ध्यान दें।
निर्माता की दिशा के अनुसार ट्रिप्टोज सल्फिटे साइक्लोसेरीन या टीएससी एगर तैयार करें, और फिर रातोंरात आरपीएम संस्कृतियों के साथ टीका लगाने के लिए सैंडविच तकनीक का उपयोग करें। पिघले हुए एगर के 10 मिलीलीटर को बाँझ पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करके प्लेटों की आधार परत तैयार करें और इसे जमना करने की अनुमति दें। शीर्ष परत के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर शेष टीएससी एगर बनाए रखें, और ध्यान से आगर आधार करने के लिए रातोंरात आरपीएम संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें।
कुछ संस्कृतियों किण्वन के कारण दबाव में हो सकता है, तो सभी उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें। बाँझ कांच के मोतियों या एक सेल स्प्रेडर के साथ इनोक्यूलिन फैलाएं, और आरपीएम को पांच से 10 मिनट के लिए एगर में अवशोषित होने की अनुमति दें। फिर, पिघले हुए टीएससी एगर के 20 मिलीलीटर को ध्यान से प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें।
पेट्री डिश ढक्कन को बदलें और टीएससी एगर को कमरे के तापमान पर पूरी तरह से जमना, फिर पकवान को उलटा करने और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें । यदि आवश्यक हो, तो टीएससी एगर में टीका लगाने से पहले आरपीएम संस्कृति के धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें। इनक्यूबेशन के बाद, बैक्टीरियल विकास के लिए प्लेटों की जांच करें।
एगर की सतह पर एरोबिक बैक्टीरिया मौजूद हो सकते हैं, जबकि एगर में एनारोबिक बैक्टीरिया एम्बेडेड होंगे। सल्फाइट को कम करने वाले बैक्टीरिया आसपास के एगर काले हो जाएंगे, और संभावित सी पर्फ्राजेन्स उपनिवेश काले और एगर में एम्बेडेड होंगे। यदि प्लेट की सतह पर एरोबिक बैक्टीरियल विकास की घनी मात्रा है, तो चयनित क्षेत्रों से उपनिवेशों को हटाने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
एगर से संदिग्ध सी perfringens कालोनियों बांधना करने के लिए एक बाँझ एकल उपयोग नेत्र ड्रॉपर का उपयोग करें, आगर भेदी से पहले हवा निष्कासित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । कॉलोनियों को 15 मिलीलीटर शंकु नली में ताजा आरपीएम के 10 मिलीलीटर में स्थानांतरित करें। कई कालोनियों को एक ही प्लेट से अलग आरपीएम संस्कृतियों में नमूना दिया जा सकता है।
शंकु नली के ढक्कन को कसकर सुरक्षित करें, उन्हें पैराफिन फिल्म में लपेटें, और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सी पर्फ्राजेन्स एक बीएसएल दो जीव है। यह हर समय उचित सुरक्षा सावधानियों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, खासकर जब रात भर आरपीएम संस्कृतियों खोलने और ध्यान से दूषित और इस्तेमाल किया मीडिया के निपटान के लिए ।
अगले दिन, रात भर संस्कृतियों को हटा दें और उन्हें टर्बिडिटी और किण्वन के लिए जांच करें, फिर डीएनए निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ें। किसी भी बसे बैक्टीरिया को तितर-बितर करने और ध्यान से ट्यूब खोलने के लिए आरपीएम संस्कृति को धीरे से उलटा करें। एक मिलीलीटर को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और अपकेंद्रित्र द्वारा बैक्टीरिया को गोली दें।
बाँझ PBS के एक मिलीलीटर के साथ गोली धोलें। यदि अपाच्य जिलेटिन बैक्टीरिया के शीर्ष पर बस गया है, तो पीबीएस के साथ आंदोलन करके इसे बंद कर दें। धीरे-धीरे जिलेटिन और पीबीएस को एस्पिरेट करें और शेष बैक्टीरियल पेलेट को ताजा पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ फिर से निलंबित करें।
सेल पैलेट की सीमित अशांति के साथ किसी भी पैलेट जिलेटिन को हटाना महत्वपूर्ण है। जिलेटिन को हटाने में विफलता डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर को बाधित कर सकती है। 10 मिनट के लिए बैक्टीरिया अपकेंद्रित्र और ध्यान से सुपरनेट आकांक्षी।
फिर विशेष रूप से ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए डिज़ाइन की गई किट का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण करें। डीएनए का तुरंत इस्तेमाल करें या माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। निकाले गए डीएनए पर पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए निर्धारित अगर संस्कृतियों सी perfringens toxinotypes के लिए सकारात्मक हैं ।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी पीसीआर रिएजेंट काम कर रहे हैं, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सी perfringens डीएनए का उपयोग करें। पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीसीआर चलाएं और एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के साथ उत्पादों का विश्लेषण करें। इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल न्यूयॉर्क रिटेल स्टोर्स से खरीदे गए कुल २१६ फूड सैंपलों का परीक्षण करने के लिए किया गया था ।
नमूनों में मांस के विभिन्न नमूने, पोल्ट्री नमूने और समुद्री भोजन के नमूने शामिल थे । सी पर्फ्राजेन्स टाइप बी का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। यह पाया गया कि 15 से 20% नमूना खाद्य पदार्थ सी पर्फ्राजेन्स के लिए सकारात्मक परीक्षण करते हैं।
३४ सकारात्मक नमूनों में से 31 नमूनों में अल्फा टॉक्सिन शामिल था, एक नमूने में अल्फा, बीटा और एप्सिलॉन टॉक्सिन शामिल थे । और दो नमूनों में अल्फा और एप्सिलॉन टॉक्सिन निहित थे । हमने विभिन्न सी परफ्रिंगन टोक्सिनोटाइप के लिए खाद्य नमूनों का परीक्षण करने के लिए एक आसान तरीका विकसित किया है।
हम विशेष रूप से टॉक्सिनोटाइप बी और डी की व्यापकता में रुचि रखते हैं जो एप्सिलॉन टॉक्सिन का उत्पादन करते हैं।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्थानीय रूप से खरीदे गए खाद्य पदार्थों में विभिन्न क्लोस्ट्रिडियम perfringens toxins का पता लगाने के लिए है, विशेष रूप से एप्सिलॉन विष तनाव प्रकार बी और डी का उत्पादन, अवायवीय कक्षों के उपयोग के बिना.
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