우리는 다른 C 퍼프린 독시 형에 대한 식품 샘플을 테스트하는 쉬운 방법을 개발했다. 우리는 엡실론 독소를 생성하는 축산형 B와 D의 보급에 특히 관심이 있습니다. 우리의 프로토콜은 혐기성 챔버 또는 제한된 하위 배양으로 인큐베이터를 사용하지 않고 다양한 C 변속 성 독시의 쉽게 농축 및 검출을 허용합니다.
이 방법은 토양, 물, 대변 샘플 등을 테스트하는 데 사용할 수도 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 주하 안와르와 사만다 리건, 실험실의 기술자입니다. 먼저 수정된 급속 한 퍼프린스 매체 또는 RPM을 준비 하 여 시작 합니다.
원고 방향에 따라 재료를 결합하고 15 분 동안 섭씨 121도에서 혼합물을 자동 복제합니다. 매체가 섭씨 약 40도까지 식힌 다음 D-cycloserine을 리터당 440 밀리그램의 최종 농도에 추가합니다. RPM을 15밀리리터 원뿔튜브로 무균적으로 전송하고 최대 1개월 동안 섭씨 4도에 보관하십시오.
사용하기 전에 중간 을 섭씨 37도까지 따뜻하게 하십시오. 시험할 샘플을 수집할 때 원고 지침에 따라 식품을 실험실로 옮길 수 있습니다. 즉시 테스트하지 않으면 음식을 영하 20도까지 보관할 수 있습니다.
음식의 종류와 원산지 국가뿐만 아니라 기타 관련 정보를 기록하십시오. 음식을 테스트하려면 약 1~2그램을 멸균 페트리 접시에 옮기고 멸균 면도날이나 메스로 잘게 다진다. 15 밀리리터 원추형 튜브에서 PBS의 10 밀리리터로 접종하고 잘 섞습니다.
PBS 식품 혼합물의 5밀리리터를 RPM 10밀리리터가 있는 15밀리리터 원내 튜브로 이송하고 뚜껑을 단단히 닫아 식물 세포를 선택하십시오. 혼합물의 나머지 5 밀리리터를 섭씨 85도로 가열하여 포자를 15분 동안 선택합니다. 그리고 RPM이있는 튜브로 옮기고 뚜껑을 단단히 닫습니다.
완벽한 혼합을 보장하기 위해, 소용돌이와 음식 RPM 문화를 반전. 그런 다음 원문 튜브를 단단히 밀봉하고 파라핀 필름으로 뚜껑을 감싸 혐기성 환경을 만듭니다. 하룻밤 사이에 튜브를 섭씨 37도에서 배양하고 다음 날 아침에 탁도 또는 발효를 기록하십시오.
제조업체의 지시에 따라 트립토세 설피테 시클로핀 또는 TSC 아가를 준비한 다음 샌드위치 기술을 사용하여 하룻밤 RPM 배양으로 접종하십시오. 용융 된 한고의 10 밀리리터를 전송하여 페트리 접시를 멸균하고 고화시켜 접시의 기본 층을 준비합니다. 나머지 TSC Agar를 최고 층의 섭씨 40도에서 유지하고 밤새 RPM 문화의 100 마이크로리터를 Agar 기지로 조심스럽게 전송합니다.
일부 문화권은 발효로 인해 압력을 받고 있을 수 있으므로 모든 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 멸균 유리 구슬 또는 세포 스프레더로 접종을 확산하고 RPM을 5~10분 동안 Agar에 흡수할 수 있도록 합니다. 그런 다음, 용융 된 TSC Agar의 20 밀리리터를 조심스럽게 접시에 옮기기 위해 세로지학적 파이펫을 사용합니다.
페트리 접시 뚜껑을 교체하고 TSC 아가가 실온에서 완전히 고화할 수 있도록 한 다음 접시를 반전시키고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양할 수 있습니다. 필요한 경우 TSC Agar에 접종하기 전에 RPM 배양의 직렬 희석을 수행하십시오. 잠복 후 세균 성장을위한 플레이트를 검사하십시오.
호기성 박테리아는 Agar의 표면에 존재할 수 있으며 혐기성 박테리아는 Agar에 내장될 것입니다. 황피테 감소 박테리아는 주변 Agar 검은 색을 켜고, 가능한 C 퍼프린 식민지는 검은 색과 Agar에 내장됩니다. 플레이트 표면에 조밀한 양의 호기성 세균 성장이 있는 경우 셀 스크레이퍼를 사용하여 선택된 부위에서 콜로니를 제거하십시오.
멸균 일회용 아이 드롭퍼를 사용하여 Agar에서 의심되는 C 가당을 뽑아 내고, Agar를 관통하기 전에 공기를 추방하십시오. 15 밀리리터 원내 튜브에서 10밀리리터의 신선한 RPM으로 식민지를 옮기. 여러 식민지는 별도의 RPM 배양으로 동일한 플레이트에서 샘플링 할 수 있습니다.
원색 튜브 뚜껑을 단단히 고정하고 파라핀 필름으로 감싸고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. C 퍼프렌스는 BSL 2유기체이다. 특히 하룻밤 사이에 RPM 문화를 열 때 항상 적절한 안전 예방 조치를 사용하고 중고 미디어를 신중하게 오염제거하고 폐기하는 것이 중요합니다.
다음 날, 하룻밤 문화를 제거하고 탁도 및 발효를 검사한 다음 DNA 추출을 진행합니다. RPM 문화를 부드럽게 반전하여 정착된 박테리아를 분산시키고 조심스럽게 튜브를 엽니다. 1 밀리리터를 미세원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 박테리아를 펠릿으로 옮긴다.
멸균 PBS의 1 밀리리터로 펠릿을 씻으십시오. 소화되지 않은 젤라틴이 박테리아 위에 정착한 경우 PBS와 교반하여 벗겨내게하십시오. 젤라틴과 PBS를 부드럽게 흡인시키고 신선한 PBS 1밀리리터로 남은 세균 펠릿을 다시 중단합니다.
세포 펠릿의 제한된 교란을 가진 어떤 펠렛 젤라틴든지 제거하는 것이 중요합니다. 젤라틴을 제거하지 못하면 DNA 추출 및 PCR이 억제될 수 있습니다. 박테리아를 10분 동안 원심분리하고 상퍼를 조심스럽게 흡인시합니다.
그런 다음 그램 양성 박테리아를 위해 특별히 설계된 키트를 사용하여 DNA 추출을 수행합니다. DNA를 즉시 사용하거나 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. 추출된 DNA에서 PCR을 수행하여 배양이 C에 대해 양성인지 여부를 결정합니다.
C를 사용하여 DNA를 긍정적 인 제어로 사용하여 모든 PCR 시약이 작동하는지 확인하십시오. 원고 방향에 따라 PCR을 실행하고 아가로즈 젤 전기 포와 제품을 분석합니다. 이 프로토콜은 뉴욕 소매점에서 구입한 총 216개의 식품 샘플을 테스트하는 데 사용되었습니다.
샘플에는 다양한 육류 샘플, 가금류 샘플 및 해산물 샘플이 포함되어 있습니다. C 퍼프린스 타입 B는 양수 대조군으로 사용되었다. 샘플링된 식품의 15~20%가 C 를 위한 양성 반응을 나타낸다는 것이 밝혀졌습니다.
34개의 양성 샘플 중 31개의 샘플은 알파 독소, 1개의 샘플에는 알파, 베타 및 엡실론 독소가 포함되어 있었다. 그리고 두 개의 샘플은 알파와 엡실론 독소를 포함했다. 우리는 다른 C 퍼프린 독시 형에 대한 식품 샘플을 테스트하는 쉬운 방법을 개발했다.
우리는 엡실론 독소를 생성하는 축산형 B와 D의 보급에 특히 관심이 있습니다.
