Berikelse og påvisning av perfringens Toxinotypes i Retail mat samples

Vi har utviklet en enkel metode for å teste matprøver for de forskjellige C perfringens toxinotypes. Vi er spesielt interessert i forekomsten av toxinotypes B og D som produserer epsilontoksinet. Vår protokoll gjør det enkelt å berike og påvisning av de ulike C-perfringene toxinotyper uten bruk av anaerobe kamre eller inkubatorer med begrenset sub-culturing.

Denne metoden kan også brukes til å teste jord, vann, fekale prøver og mer. Demonstrere prosedyren vil være Zuha Anwar og Samantha Regan, teknikere fra laboratoriet. Begynn med å klargjøre modifiserte raske perfringens medium, eller RPM.

Kombiner ingredienser i henhold til manuskriptretninger, og autoklav blandingen ved 121 grader Celsius i 15 minutter. La mediet avkjøles til ca 40 grader Celsius, og tilsett deretter D-cycloserine til en endelig konsentrasjon på 440 milligram per liter. Aseptisk overføre RPM til 15 milliliter koniske rør, og lagre på fire grader Celsius i opptil en måned.

Før bruk, varm mediet til 37 grader Celsius. Når du samler prøver som skal testes, overfør maten til laboratoriet i henhold til manuskriptretninger. Hvis ikke testing umiddelbart, kan maten lagres ved minus 20 grader Celsius.

Legg merke til hvilken type mat og opprinnelseslandet, samt annen relevant informasjon. For å teste maten, overfør omtrent ett til to gram til en steril petriskål, og fin hakke den med et sterilt barberblad eller skalpell. Inokuler den i 10 milliliter PBS i et konisk rør på 15 milliliter, og bland godt.

Velg for vegetative celler ved å overføre fem milliliter av PBS matblandingen til et 15 milliliter konisk rør med 10 milliliter RPM og lukke lokket tett. Velg for sporer ved å varme de resterende fem milliliter av blandingen til 85 grader Celsius i 15 minutter. Og deretter overføre den til et rør med RPM og lukke lokket tett.

For å sikre fullstendig blanding, vortex og invertere maten RPM kulturer. Deretter tett forsegler de koniske rørene og vikler lokkene med parafinfilm for å skape et anaerobt miljø. Inkuber rørene over natten ved 37 grader Celsius og legg merke til eventuell turbiditet eller gjæring neste morgen.

Forbered Tryptose Sulfite Cycloserine eller TSC Agar i henhold til produsentens retning, og bruk deretter sandwichteknikken til å inokulere den med rpm-kulturer over natten. Forbered bunnlaget av platene ved å overføre 10 milliliter av den smeltede Agar for å sterile Petrie-retter og la den stivne. Opprettholde de resterende TSC Agar på 40 grader Celsius for det øverste laget, og nøye overføre 100 mikroliter av natten RPM kultur til Agar base.

Noen kulturer kan være under press på grunn av gjæring, så sørg for å bruke alt passende personlig verneutstyr. Spred inoculine med sterile glassperler eller en cellespreder, og la RPM absorberes i Agar i fem til 10 minutter. Deretter bruker du en serologisk pipette til å forsiktig overføre 20 milliliter av den smeltede TSC Agar til platen.

Bytt petriskållokket og la TSC Agar stivne ved romtemperatur, og inverter deretter parabolen og inkuber den ved 37 grader Celsius over natten. Utfør om nødvendig seriell fortynning av RPM-kulturen før inokulasjon i TSC Agar. Etter inkubasjonen, undersøke plater for bakteriell vekst.

Aerobe bakterier kan være til stede på overflaten av Agar, mens anaerobe bakterier vil bli innebygd i Agar. Sulfite redusere bakterier vil slå den omkringliggende Agar svart, og mulig C perfringens kolonier vil være svart og innebygd i Agar. Hvis det er en tett mengde aerob bakteriell vekst på overflaten av platen, bruk en celleskraper til å fjerne kolonier fra utvalgte områder.

Bruk en steril engangs øyedråper til å plukke de mistenkte C perfringens kolonier fra Agar, sørg for å utvise luften før piercing Agar. Overfør koloniene til 10 milliliter frisk rpm i et konisk rør på 15 milliliter. Flere kolonier kan prøves fra samme plate til separate RPM-kulturer.

Fest de koniske rørlokkene tett, pakk dem inn i parafinfilm og inkuber dem over natten ved 37 grader Celsius. C perfringens er en BSL to organisme. Det er viktig å bruke riktige sikkerhetsforanstaltninger til enhver tid, spesielt når du åpner rpm-kulturer over natten og å forsiktig dekontaminere og avhende brukte medier.

På neste dag fjerner du overnattingskulturene og undersøker dem for turbiditet og gjæring, og fortsett deretter med DNA-ekstraksjon. Inverter RPM-kulturen forsiktig for å spre eventuelle avgjorte bakterier og åpne røret forsiktig. Overfør en milliliter til et mikrocentrifugerør og pellet bakteriene ved sentrifugering.

Vask pelleten med en milliliter steril PBS. Hvis ufordøyd gelatin har slått seg ned på toppen av bakteriene, fluff det av ved å agitere med PBS. Aspirer forsiktig gelatin og PBS og re-suspendere gjenværende bakteriell pellet med en milliliter frisk PBS.

Det er viktig å fjerne pelleted gelatin med begrenset forstyrrelse av cellepellet. Hvis gelatinen ikke fjernes, kan det hemme DNA-ekstraksjon og PCR. Sentrifuger bakteriene i 10 minutter og aspirer forsiktig overnatanten.

Utfør deretter DNA-ekstraksjon ved hjelp av et sett som er spesielt designet for gram positive bakterier. Bruk DNA umiddelbart eller lagre det på minus 20 grader Celsius. Utfør PCR på det ekstraherte DNA-et for å finne ut om kulturene er positive for C-perfringens toxinotyper.

Bruk C perfringens DNA som en positiv kontroll for å sikre at alle PCR-reagenser fungerer. Kjør PCR i henhold til manuskriptretninger og analyser produktene med agarose gel elektroforese. Denne protokollen ble brukt til å teste totalt 216 matprøver kjøpt fra New York butikker.

Prøvene omfattet ulike kjøttprøver, fjørfeprøver og sjømatprøver. C perfringens Type B ble brukt som en positiv kontroll. Det ble funnet at 15 til 20% av samplet mat tester positivt for C perfringens.

Av de 34 positive prøvene inneholdt 31 prøver alfatoksinet, en prøve inneholdt alfa, beta og epsilontoksin. Og to prøver inneholdt alfa og epsilontoksin. Vi har utviklet en enkel metode for å teste matprøver for de forskjellige C perfringens toxinotypes.

Vi er spesielt interessert i forekomsten av toxinotypes B og D som produserer epsilontoksinet.