Anrikning och påvisande av Clostridium perfringens toxinotyper i detaljhandels livsmedelsprov

Vi har utvecklat en enkel metod för att testa matprover för de olika C-perfringens toxinotyperna. Vi är särskilt intresserade av prevalensen av toxinotyper B och D som producerar epsilon toxinet. Vårt protokoll tillåter enkel anrikning och detektion av de olika C perfringens toxinotyper utan användning av anaeroba kammare eller inkubatorer med begränsad sub-culturing.

Denna metod kan också användas för att testa jord, vatten, fekal prover, och mer. Demonstrera förfarandet kommer att Zuha Anwar och Samantha Regan, tekniker från labbet. Börja med att förbereda modifierad snabb perfringens medium, eller RPM.

Kombinera ingredienser enligt manuskriptriktningar, och autoklav blandningen vid 121 grader Celsius i 15 minuter. Låt mediet svalna till cirka 40 grader Celsius, tillsätt sedan D-cycloserine till en slutlig koncentration av 440 milligram per liter. Aseptiskt överföra RPM till 15 milliliter koniska rör, och lagra på fyra grader Celsius i upp till en månad.

Innan du använder, värm mediet till 37 grader Celsius. Vid insamling av prover som ska testas, överför maten till laboratoriet enligt manuskriptriktningar. Om inte testa omedelbart, maten kan lagras vid minus 20 grader Celsius.

Anteckna typ av livsmedel och ursprungsland, samt all annan relevant information. För att testa maten, överför ungefär ett till två gram till en steril petriskål, och finhacka den med ett sterilt rakblad eller skalpell. Inokulera den i 10 milliliter PBS i en 15 milliliter koniska rör, och blanda väl.

Välj för vegetativa celler genom att överföra fem milliliter av PBS-matblandningen till ett koniskt rör på 15 milliliter med 10 milliliter RPM och stänga locket tätt. Välj för sporer genom att värma de återstående fem milliliter av blandningen till 85 grader Celsius i 15 minuter. Och sedan överföra den till ett rör med RPM och stänga locket tätt.

För att säkerställa fullständig blandning, virvel och invertera maten RPM kulturer. Sedan tätt försegla koniska rören och linda locken med paraffin film för att skapa en anaerob miljö. Inkubera rören över natten vid 37 grader Celsius och notera eventuell grumlighet eller jäsning på följande morgon.

Förbered Tryptose Sulfite Cycloserine eller TSC Agar enligt tillverkarens riktning, och sedan använda sandwichtekniken för att vaccinera den med över nattens RPM-kulturer. Bered plattornas underställ genom att överföra 10 milliliter av den smälta Agar till sterila petriskålar och låta det stelna. Underhåll de återstående TSC Agar vid 40 grader Celsius för det översta lagret, och noggrant överföra 100 mikroliter av natten RPM kultur till Agar basen.

Vissa kulturer kan vara under tryck på grund av jäsning, så se till att bära all lämplig personlig skyddsutrustning. Sprid inoculin med sterila glaspärlor eller en cellspridare, och låt RPM absorberas i Agar i fem till 10 minuter. Använd sedan en serologisk pipett för att noggrant överföra 20 milliliter av den smälta TSC Agar till plattan.

Byt förstena skålen locket och låt TSC Agar att helt stelna vid rumstemperatur, sedan invertera skålen och inkubera den vid 37 grader Celsius över natten. Om det krävs, utför serieutspädningar av RPM-odlingen före inokulering i TSC Agar. Efter inkubationen, undersöka plattor för bakterietillväxt.

Aeroba bakterier kan finnas på ytan av Agar, medan anaeroba bakterier kommer att bäddas in i Agar. Sulfit minska bakterier kommer att vända den omgivande Agar svart, och eventuella C perfringens kolonier kommer att vara svart och inbäddade i Agar. Om det finns en tät mängd aerob bakterietillväxt på ytan av plattan, använd en cellskrapa för att avlägsna kolonier från utvalda områden.

Använd en steril engångsögondropare för att plocka de misstänkta C-perfringens kolonierna från Agar, se till att utvisa luften innan piercing agar. Överför kolonierna till 10 milliliter färsk RPM i ett koniskt rör på 15 milliliter. Flera kolonier kunde provsmakas från samma platta till separata RPM-kulturer.

Tätt säkra koniska rörlock, linda in dem i paraffinfilm och inkubera dem över natten vid 37 grader Celsius. C perfringens är en BSL två organism. Det är viktigt att använda ordentliga säkerhetsåtgärder hela tiden, särskilt när du öppnar över natten RPM kulturer och att noggrant sanera och avyttra använda medier.

På nästa dag, ta bort natten kulturer och undersöka dem för grumlighet och jäsning, sedan fortsätta med DNA-extraktion. Försiktigt invertera RPM-kulturen för att skingra eventuella avgjorda bakterier och försiktigt öppna röret. Överför en milliliter till ett mikrocentrifugrör och pellet bakterierna genom centrifugering.

Tvätta pelleten med en milliliter steril PBS. Om osmält gelatin har bosatt sig på toppen av bakterierna, fluff bort det genom att agitera med PBS. Aspirera försiktigt gelatinet och PBS och åter upphäva den återstående bakteriepelleten med en milliliter färsk PBS.

Det är viktigt att avlägsna eventuell pelleterad gelatin med begränsad störning av cellpelletsen. Underlåtenhet att ta bort gelatin kan hämma DNA-extraktion och PCR. Centrifugera bakterierna i 10 minuter och aspirera försiktigt supernatanten.

Utför sedan DNA-extraktion med hjälp av ett kit som är särskilt utformat för grampositiva bakterier. Använd DNA:t omedelbart eller förvara det på minus 20 grader Celsius. Utför PCR på det extraherade DNA för att avgöra om kulturerna är positiva för C perfringens toxinotyper.

Använd C perfringens DNA som en positiv kontroll för att säkerställa att alla PCR-reagenser fungerar. Kör PCR enligt manuskriptriktningar och analysera produkterna med agarosgelelektrofores. Detta protokoll användes för att testa totalt 216 livsmedelsprover som köpts från New Yorks butiker.

Prover ingår olika köttprover, prover fjäderfä, och skaldjur prover. C perfringens Typ B användes som en positiv kontroll. Det konstaterades att 15 till 20% av provmat testa positivt för C perfringens.

Av de 34 positiva proverna innehöll 31 prover alfatoxinet, ett prov innehöll alfa-, beta- och epsilontoxinet. Och två prover innehöll alfa- och epsilontoxinet. Vi har utvecklat en enkel metod för att testa matprover för de olika C-perfringens toxinotyperna.

Vi är särskilt intresserade av prevalensen av toxinotyper B och D som producerar epsilon toxinet.