Deze methogenetica grote hoeveelheid 3D hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van de fijne materialen en cellen van de assemblage. De belangrijkste vooruitgang van deze techniek is dat het mogelijk maakt het beheersen van de grootte van de 3D-lever bollen, het beperken van de vorming van necrotische centra en verlies van fenotype. Het aantonen van de procedure met mij zal Yu Wang, een post-doctoraat in ons laboratorium.
Bereid je voor om agarose mallen te presenteren door het oplossen van twee gram laag smeltende temperatuur agarose in 100 milliliter gesteriliseerd water. Verwarm het mengsel in de magnetron voorzichtig met intervalschuding om de agarose volledig op te lossen. Voeg 520 microliters van de gesmolten agarose toe aan een 256 goed formaat mal en laat het stollen.
Breng vervolgens elke agarose microplaat over in een enkele put van een 12-putplaat. Voeg 1,5 milliliter DPBS met calcium en magnesium toe aan elke put en pipet op en neer om bellen te verwijderen. Om de celsuspensie voor te bereiden, begin met het opslokken van het medium uit een ongedifferentieerde cultuur van menselijke pluripotente stamcellen, of HPSCs.
Spoel de cellen door het toevoegen van vijf milliliter kamertemperatuur DPBS, calcium, of magnesium vrij en verwijder vervolgens de buffer. Voeg vijf milliliter van cel dissociatie reagens aan de cellen en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende zes tot acht minuten. Observeer celloslating onder een microscoop en verleng de incubatie desgegens extra een of twee minuten indien nodig.
Stop de reactie door het reagens van de celdissociatie te verwijderen en vijf milliliter verse MT toe te voegen, dient u een medium aangevuld met 10 micromolarrottieremmer, Y27632. Pipet meerdere keren op en neer om cellen te scheiden. Tel de levensvatbare cellen met de hemocytometer en trypan blauwe kleuring om het totale aantal cellen nodig te berekenen.
Breng het gewenste aantal cellen over naar een steriele centrifugebuis van 15 of 50 milliliter en centrifuge bij 200 keer G gedurende vijf minuten om de cellen te pelleteren. Gooi de supernatant weg en schort de cellen in MT opnieuw op, serveer een medium met 10 micromolar rotsremmer voor een uiteindelijke concentratie van 2,1 miljoen cellen per milliliter. Sla vervolgens de cellen op door 190 microliters voorbereide celsuspensie per agarose microput toe te voegen en de agarose microplaten bij 37 graden Celsius twee uur lang in vijf procent kooldioxide uit te broeden.
Voeg na de incubatie een milliliter vers, warm, T-serveer een medium met rotsremmer aan elke put. Breng de platen terug naar de couveuse en laat ze daar 24 uur staan. Op de volgende dag, onderzoek de sfeer van de vorming.
Bereid poly-twee hydroxyethyl methacrylaat of poly-hema gecoate putten door het oplossen van twee gram poly-hema in 100 milliliter van 95%ethanol en roeren de oplossing 's nachts op een 55 graden Celsius hete plaat. Voeg de volgende dag 250 microliter van de oplossing toe aan elke put van een 24-putplaat en droog de plaat 's nachts in een oven van 60 graden Celsius. Initiëren hepatocyte differentiatie door zorgvuldig verwijderen van de MT dienen een medium uit de eerder gezaaide cellen en te vervangen door een milliliter van verse endoderm differentiatie medium.
Voor menselijke embryonale stamcellen, refresh medium om de 24 uur gedurende drie dagen. Het is belangrijk om hepatocyte differentiatie 24 uur na het zaaien te starten om spontane celdifferentiatie te voorkomen. Na de definitieve endoderm inductie, schakel het medium naar hepatoblast differentiatie medium voor vijf dagen.
Vervang het medium om de twee dagen en voert de laatste wijziging uit op de laatste dag van de hepatoblast-specificatie. Om de hepatosferen over te brengen in de geprepareerde poly-hema gecoate putten, was de cellen met hepatocyte rijping medium en voeg vervolgens een milliliter van het medium aangevuld met 10 nanogram per milliliter HGF en 20 nanogram per milliliter OSM. Pipette de oplossing op en neer meerdere malen om de hepatosferen te tillen van de agarose micro plaat en breng ze naar een poly-hema gecoat goed.
Was de agarose microplaat met een milliliter van het aangevulde hepatocytenrijpaturatiemedium en breng het medium over op de poly-hema goed gecoat. Met behulp van een P-100 pipet, zorgvuldig aanzuigen overtollig medium zonder het verwijderen van hepatosferen totdat er ongeveer een milliliter medium links in de put. Vernieuw het medium elke 48 uur gedurende 12 dagen.
Als u met embryonale stamcellen werkt, schakelt u het medium in om het onderhoudsmedium op dag 20 te hepatocyte door het rijpingsmedium te verwijderen, de cellen met onderhoudsmedium te wassen en vervolgens een milliliter aanvullend onderhoudsmedium toe te voegen. Daarna ververst u het medium om de 48 uur. Onmiddellijke veranderingen moeten zorgvuldig worden uitgevoerd om ernstige stress en vervorming van deze bolvormige structuur te voorkomen.
Vlekken voor hepatocyte in mesenchymale markers revels dat de hepatospheres gevormd met behulp van deze techniek zijn samengesteld uit hepatocyte-achtige cellen rond een kern van mesenchymale cellen. Andere eiwitten meestal uitgedrukt in hepatocyten zijn ook te vinden op de buitenste laag van de bollen. Functionele analyse van cytochrome P450 enzymen of CYP in 30 dagen hepatosfeer culturen bleek dat de 3D-bollen respectabele niveaus van CYP activiteit in vergelijking met de menselijke primaire hepatocyten weer te geven.
Bovendien kan worden aangetoond dat de hepatospheres levereiwitten afscheiden zoals Albumin en alfa-fetoproteïne. Het belangrijkste om te onthouden voor dit protocol is om voorzichtig pipette op en neer de oplossing met 3D hepatospheres bij het overbrengen van hen in de poly-hema gecoate plaat. Dit helpt voorkomen dat ze beschadigd.
Eenmaal onder de knie, deze methodologie maakt het mogelijk de generatie van 3D-lever sferen die functioneel blijven meer dan een jaar in-vitro met meerdere toepassingen in decease modellering en drug screening. Vooruitblikkend, kan deze technologie worden gebruikt als een platform om verdere entodermale en mesenchymale weefsels met complexe architecturen te ontwikkelen.
