Dette methogenetics store mengder 3D hepatospheres av menneskelige pluripotente stamceller ved hjelp av fine materialer og celler av montering. Hovedforskuddet av denne teknikken er at den gjør det mulig å kontrollere størrelsen på 3D-leversfærene, begrense dannelsen av nekrotiske sentre og tap av fenotype. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Yu Wang, en postdoktorgrad i laboratoriet vårt.
Forbered deg på å presentere agaroseformer ved å oppløse to gram lavsmeltende temperatur oppsto i 100 milliliter sterilisert destillert vann. Varm forsiktig blandingen i mikrobølgeovnen med intervallristing for å oppløse agarose helt. Tilsett 520 mikroliter av smeltet agarose til en 256 brønnformatform og la den stivne.
Deretter overfører hver agarose mikroplate til en enkelt brønn av en 12-brønns plate. Tilsett 1,5 milliliter DPBS med kalsium og magnesium til hver brønn og pipette opp og ned for å fjerne bobler. For å forberede cellefjæringen, start med å aspirere mediet fra en udifferensiert kultur av menneskelige pluripotente stamceller, eller HPSCer.
Skyll cellene ved å legge til fem milliliter romtemperatur DPBS, kalsium eller magnesiumfri og fjern deretter bufferen. Tilsett fem milliliter celledissosiasjonsreagens til cellene og inkuber ved 37 grader Celsius i seks til åtte minutter. Vær oppmerksom på celleavløsning under et mikroskop og utvid inkubasjonen i ytterligere ett eller to minutter om nødvendig.
Stopp reaksjonen ved å fjerne celledissosiasjonsreagensen og tilsett fem milliliter fersk MT tjener ett medium supplert med 10 mikromolar berghemmer, Y27632. Pipette opp og ned flere ganger for å ta avstand fra celler. Telle levedyktige celler med hemocytometeret og trypan blå flekker for å beregne det totale antall celler som trengs.
Overfør ønsket antall celler til et sterilt 15 eller 50 milliliter sentrifugerør og sentrifuge ved 200 ganger G i fem minutter for å pellet cellene. Kast de supernatante og re-suspendere cellene i MT tjene ett medium med 10 mikromolar steinhemmer for en endelig konsentrasjon på 2,1 millioner celler per milliliter. Deretter lagrer cellene ved å legge til 190 mikroliter forberedt cellesuspensjon per agarose mikrobrønn og inkubere agarose mikroplatene ved 37 grader Celsius i fem prosent karbondioksid i to timer.
Etter inkubasjonen, tilsett en milliliter frisk, varm, T-server ett medium med steinhemmer til hver brønn. Returner platene til inkubatoren og la dem være der i 24 timer. På neste dag, undersøke formasjonssfæren.
Forbered poly-to hydroksyetylmetakrylat eller poly-hemabelagte brønner ved å oppløse to gram poly-hema i 100 milliliter 95% etanol og røre løsningen over natten på en 55 graders Celsius kokeplate. På neste dag legger du til 250 mikroliter av løsningen til hver brønn av en 24-brønns plate og tørker platen over natten i en 60 grader Celsius-ovn. Initier hepatocyttdividering ved å forsiktig fjerne MT-en, server ett medium fra de tidligere seedede cellene og erstatte den med en milliliter frisk endoderm differensieringsmedium.
For humane embryonale stamceller, oppdater medium hver 24. Det er viktig å initiere hepatocytt differensiering 24 timer etter såing for å unngå spontan celledividering. Etter definitiv endoderm induksjon, bytt medium til hepatoblast differensieringsmedium i fem dager.
Erstatt mediet annenhver dag, og utfører den siste endringen på den siste dagen av hepatoblastspesifikasjonen. For å overføre hepatosfærene til de tilberedte poly-hemabelagte brønnene, vask cellene med hepatocyttmodningsmedium og legg deretter til en milliliter av mediet supplert med 10 nanogram per milliliter HGF og 20 nanogram per milliliter OSM. Pipette løsningen opp og ned flere ganger for å løfte hepatosfærene fra agarose mikroplaten og overføre dem til en poly-hema belagt godt.
Vask agarose mikroplaten med en milliliter av det supplerte hepatocyttmodningsmediet og overfør mediet til poly-hema belagt godt. Bruk en P-100 pipette, forsiktig aspirere overflødig medium uten å fjerne hepatosfærer til det er omtrent en milliliter medium igjen i brønnen. Oppdater mediet hver 48.
Hvis du arbeider med embryonale stamceller, bytt medium til hepatocyte vedlikeholdsmedium på dag 20 ved å fjerne modningsmediet, vaske cellene med vedlikeholdsmedium, og deretter legge til en milliliter med supplert vedlikeholdsmedium. Etter dette oppdaterer du medium hver 48. Umiddelbare endringer må utføres nøye for å unngå alvorlig stress og forvrengning av denne sfæriske strukturen.
Farging for hepatocytter i mesenchymale markører fråtser at hepatosfærene dannet ved hjelp av denne teknikken består av hepatocytterlignende celler som omgir en kjerne av mesenchymale celler. Andre proteiner som vanligvis uttrykkes i hepatocytter finnes også på det ytre laget av kulene. Funksjonell analyse av cytokrom P450 enzymer eller CYP i 30 dagers hepatosfærekulturer viste at 3D-sfærene viser respektable nivåer av CYP-aktivitet sammenlignet med humane primære hepatocytter.
Videre kan det demonstreres at hepatosfærene utskiller leverproteiner som Albumin og alfa-fetoprotein. Det viktigste å huske for denne protokollen er å forsiktig pipette opp og ned løsningen som inneholder 3D hepatospheres når du overfører dem til poly-hema belagt plate. Dette bidrar til å unngå å skade dem.
Når mestret, denne metodikken tillater generering av 3D leverkuler som forblir funksjonelle over et år in-vitro med flere applikasjoner i avdøde modellering og narkotika screening. Ser fremover, denne teknologien kan brukes som en plattform for å utvikle ytterligere entodermal og mesenchymal vev med komplekse arkitekturer.