Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

ويود المؤلفون ان يشكروا فيروس نقص المناعة البيولوجية/الأورام الحيوية النواة لتوفير عينات المريض والنواة الأيض المناعة الخلوية لتوفير تحليل تدفق الخلوي. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة P20GM121288 و P30GM114732.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموضحة أدناه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمركز نيو اورليانز للعلوم الصحية بجامعه ولاية لويزيانا. تم جمع جميع الدم بعد الحصول علي موافقه مستنيرة.
ملاحظه: يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في ظل ظروف معقمه في مرفق مستوي السلامة الاحيائيه 2 (BSL2) بحيث يتم ا?...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

ويبين البروتوكول المعروض استخدام الخلايا الاوليه من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية كنموذج لدراسة البويضات والضامات. فيروس نقص المناعة الذاتية + المرضي الذين يخضعون لعربه العيش مع العدوى لسنوات متعددة ، ويمكن أيضا ان يكون لها آخر العدوى المشتركة ذات الصلة جهاز المناعة...

تسبب عدوي فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1) خللا مناعيا شديدا ، وهو ما يمكن ان يؤدي إلى الاصابه بالعدوى الانتهازية ومتلازمة عوز المناعة المكتسب (الإيدز). علي الرغم من ان المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة التي تمر بالعربة تتميز الأحمال الفيروسية المنخفضة والعد العادية الخلايا التائية + T ، ويمكن المساس بأداء الجهاز المناعي في هؤلاء الافراد ، مما يؤدي إلى استجابه مناعية مختلة التي ارتبطت بزيادة خطر الاصابه بالسرطان1 أليات الخلل المناعي في مرضي فيروس نقص المناعة الذاتية علي السلة لا تزال غير معروفه إلى حد كبير. ولذلك ، فان توصيف الخلايا المناعية المستمدة من المريض والتحقيق في علم الاحياء والوظيفة عنصر حاسم في البحوث الحالية بفيروس نقص المناعة المكتسب.
الخلايا الاحاديه والضامة هي المنظمين الرئيسيين للاستجابات المناعية وتلعب أدوارا أساسيه في الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية2,3,4,5. غير متجانسة والبلاستيك في الطبيعة ، ويمكن تصنيف الضامة علي نطاق واسع في تنشيط كلاسيكي (M1) أو بدلا من ذلك تنشيط (M2). في حين ان هذا التصنيف العام ضروري عند اعداد الشروط التجريبية ، قد يتم عكس حاله الاستقطاب من الضامة من قبل مجموعه متنوعة من السايتوكينات6،7،8،9. علي الرغم من ان العديد من الدراسات قد حققت في اثار الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية علي الخلايا الاحاديه والجذعية ، والتفاصيل الجزيئية للاستجابات بوساطة البويضات غير معروفه إلى حد كبير6،7،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19 من بين العوامل التي تنطوي عليها تنظيم الخلايا المناعية ووظيفتها ، ميكرورناس (miRNAs) ، قصيرة غير الترميز RNAs ان ما بعد الهيستونات تنظيم التعبير الجيني ، وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في سياق المسارات الخلوية الرئيسية (اي النمو ، والتمايز ، والتنمية ، والمبرمج)20. وقد وصفت هذه الجزيئات بأنها منظمات هامه من عوامل النسخ الاساسيه لإملاء الاستقطاب وظيفية من الضامة21. وقد تم التحقيق في الدور المحتمل لmirnas في الخلايا الاحاديه من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق ، ولكن التقدم في هذا المجال يتطلب المزيد من العمل22،23،24،25،26. تناقش هذه الورقة طريقه محسنه لتحويل miRNAs و siRNAs إلى خلايا بشريه أساسيه من المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية والضوابط.
يعتمد هذا البروتوكول علي الكواشف ومجموعات المواد المتاحة تجاريا ، لان الاستمرارية في الإجراءات التقنية تساعد علي أزاله المتغيرات التجريبية غير الضرورية عند العمل مع العينات السريرية. ومع ذلك ، فان الطريقة توفر نصائح هامه (اي عدد الخلايا المطلية أو الحاضنة القصيرة مع وسائل الاعلام الخالية من المصل لتعزيز التصاق الخلايا بالصفيحة). الاضافه إلى ذلك ، فان شروط الاستقطاب المستخدمة في هذا البروتوكول مستمده من الاعمال المنشورة27و28و29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

ولا يزال فيروس نقص المناعة البشرية أحد الشواغل الصحية الرئيسية علي الرغم من إدخال العلاج المضاد للفيروسات العكوسه في منتصف التسعينيات من القرن العشرين. في حين ان العلاج المضاد للفيروسات الرجعية يخفض بكفاءة الحمل الفيروسي الجهازي ويستعيد العد الطبيعي للخلاياالتائية ، فانه لا يعيد تشكيل جهاز مناعي وظيفي تماما. يمكن ان يتميز جهاز المناعة المختل في الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق بالتنشيط المناعي ، والشيخوخة المبكرة للخلايا المناعية ، أو التهاب المستمر. وتضيف هذه الشروط ، إلى جانب العوامل المصاحبة للاصابه بالفيروس ، تعقيدا إلى المرض ، الذي لا يمكن استنساخه بسهوله في النماذج الخلوية والحيوانية. للتحقيق في الاحداث الجزيئية الكامنة وراء الخلل المناعي في هؤلاء المرضي ، يتم عرض نظام للثقافة والتلاعب بالخلايا الوحيدة الاساسيه البشرية في المختبر هنا. وعلي وجه التحديد ، يسمح البروتوكول للثقافة والانتقال من CD14 الابتدائية + مونوسيدات التي تم الحصول عليها من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب الذين يخضعون لعربه التسوق وكذلك من الضوابط السلبية لفيروس نقص المناعة المكتسب. وتشمل هذه الطريقة العزلة والثقافة والانتقال من الخلايا الاحاديه والضامة المشتقة من البويضات. في حين يتم استخدام مجموعات المتاحة تجاريا والكواشف, البروتوكول يوفر نصائح هامه والظروف المثلي للانضمام الناجحة والانتقال من الخلايا الاحاديه مع محاكاة ميرنا ومثبطات وكذلك مع siRNAs.

وباستخدام الاجراء الموصوف ، تم عزل الخلايا البشرية الاوليه من الافراد المصابين بالفيروس والمتبرعين الأصحاء. تم الحصول علي جميع البيانات المعروضة هنا من فيروس نقص المناعةالمكتسب + الموضوعات التي تخضع لعربه مع منخفضه (< 20 نسخ/مل) أو الأحمال الفيروسية غير قابل للكشف و...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

المعروض هنا هو بروتوكول الأمثل لعزل ، والزراعة ، ونقل ، والتفريق بين الخلايا الاساسيه البشرية من الافراد المصابين بالفيروس والضوابط الصحية.

العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

وتسبب الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية خللاً في المناعة حتى لدى الأفراد الذين يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات العكوسة دون وجود فيروس يمكن اكتشافه. هذه الطريقة تسمح لدراسة وظيفة أحادية التي هي المنظمين الرئيسية للاستجابة المناعية. لقد قمنا بتحسين هذه التقنية لعزلة وثقافة وtransfection من أحاديات الإنسان الأولية.نحن نستخدم هذه الطريقة لفهم الآليات الجزيئية للخلل المناعي لدى الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن يمكن تطبيقها على أي دراسات مناعية أخرى تتضمن الخلايا الأحادية. إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي تعمل فيها مع الدم البشري، فتذكر أن تتبع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة وأن تعامل جميع العينات على أنها مواد معدية. بعد جمع 40 ملليلتر من الدم البشري الكامل الطازج في أربعة 10 ملليلتر EDTA أنابيب فراغ، واستخدام تقنية معقمة لنقل كل من الدم في أنبوب بروبيلين مخروطي 50 ملليلتر واحد في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.بعد تعليمات الشركة المصنعة من مجموعة العزل أحادية الإنسان المحدد، إضافة ملليلترين من كوكتيل العزل أحادية من عدة إلى أنبوب الدم ودوامة الخرز المغناطيسي من عدة لمدة 30 ثانية. إضافة ملليلترين من الخرز إلى الدم واستخدام ماصة المصلية 25 ملليلتر لخلط بعناية الخرز مع الدم. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتقسيم الدم بالتساوي بين أربعة أنابيب 50 ملليلتر وإضافة 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم تكملها EDTA ملليمولار واحد إلى كل أنبوب.تخلط مرة أخرى مع ماصة بلاستيكية 25 ملليلتر المصلية ووضع الأنابيب في حاملات المغناطيسي. بعد 10 دقائق، واستخدام ماصة لرسم محتويات من وسط كل أنبوب مع الحرص على عدم التعرق أكثر من ملليلتر من خلايا الدم الحمراء والاستغناء عن محتويات الأنبوب في واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. أضف 500 ميكرولترات إضافية من الخرز المغناطيسي الدوامة إلى كل أنبوب وخلط بلطف حل الخلية.ضع الأنابيب مرة أخرى في الاقحام المغناطيسي لمدة خمس دقائق قبل نقل المحتويات بعناية من وسط كل أنبوب إلى واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. عندما تم نقل جميع تعليق الخلية، ضع كل أنبوب 50 ملليلتر جديد في حاملات المغناطيس لمدة خمس دقائق قبل نقل محتويات الأنبوب بعناية إلى مجموعة ثالثة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق جميع الكريات الخلية الأربعة في ما مجموعه 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة للعد.بعد عد, resuspend أحادية معزولة في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من 37 درجة مئوية الدم 1640 المتوسطة خالية من المصل تكملها المضادات الحيوية وطبقة ملليلتر واحد من الخلايا resuspended في 35 ملليمتر لوحات في مجلس الوزراء السلامة الحيوية. ثم ضع اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بالتمسك بأسفل البئر. إلى رئيس ل الضامة مع نمط ظاهري يشبه M1 ، إضافة 100 ميكرولتر من مصل البقر الجنينية التي تحتوي على 25 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى كل لوحة.إلى رئيس للضامة مع نمط ظاهري يشبه M2 ، أضف 100 ميكرولتر من الأبقار الجنينية التي تحتوي على 50 نانوغرام لكل ملليلتر من M-CSF إلى كل لوحة. بالنسبة لtransfection أحادية مع ميكرورنا تقليد، مثبطات، أو الحمض النووي الريبي التدخلي الصغيرة، بعد بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة transfection، تمييع الحمض النووي الريبي المختار في المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي من 1.83 ميكرومولار في 10 ميكرولترات من تقليد المخفف أو لكل مثبطات من مرة واحدة 10 إلى حجم الخلايا الخامسة. لإعداد كاشف transfection ، إضافة ميكرولتر واحد من البوليمر المقدمة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، وعلى الفور إضافة 90 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقدمة عدة للحصول على ما مجموعه 91 ميكرولترات من كاشف لكل transfection.دوامة ريجنت لمدة ثلاث إلى خمس ثوان والماصات 90 ميكرولترات من حل transfection في أنبوب يحتوي على 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المخفف. بعد خلط لطيف، احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 100 ميكرولترات من مجمع transfection إلى بئر واحد من الخلايا. بعد أربع ساعات في 37 درجة مئوية، استبدال المتوسطة مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل تحتوي على عامل النمو المناسب.في اليوم السادس من الثقافة، استبدل المستفحلين في الثقافة من ثقافات M1 بثلاثة ملليلترات متوسطة مكمّلة بمصل الأبقار الجنينية، والمضادات الحيوية، وليبوبوليكساكريد، وترفيرفيرون غاما واستبدلوا المستفحلين من ثقافات M2 بمصل بوفين الجنيني، والمضادات الحيوية، و M-CSF، وinterleukin-4. بعد 24 ساعة من الثقافة، اغسل كل لوحة من الضامة المنشطة مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. بالنسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبروتين، فإن الخلايا المرفقة مباشرة في اللوحات تسمح بجمع محتويات الخلايا المفرج عنها لتحليلها.لتحليل تدفق cytometric، فصل الخلايا مع اثنين من ملليمولار EDTA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية قبل كشط الخلايا بلطف من قيعان لوحة للسماح جمعها في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لتحليلها. هنا يتم عرض الرسوم البيانية التمثيلية لـ M1-تنشيط التحكم والخلايا المشتقة من المريض مع زيادة مستويات الخلايا CD80 و CD83-تنشيط M2 مع زيادة مستويات CD163 و CD209 بالمقارنة مع الخلايا T0 غير المنشط. ومن المثير للاهتمام أن CD80 و CD83 يبدو أن أكثر تعبيراً في الخلايا المشتقة من التحكم مقارنة بالخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية.إن نقل الخلايا الأحادية التي تم جمعها حديثًا مع ميكرورنا المُعَدَّد من الأشعة تحت الحمراء المُشوشة التي تحمل اسم ميكرورنا يؤدي إلى زيادة كفاءة 90٪ من عمليات التنقّل على النحو الذي تحدده عملية استئصال الخلايا المتدفقة والمجهر المجهري. بالإضافة إلى ذلك، لا يقلل نقل الدم بشكل كبير من صلاحية الخلايا المشتقة من المريض أو السيطرة عليها بغض النظر عن مرحلة نضوج الخلايا أو ظروف النقل. ينتج عن عملية نقل الدرن تنظيمًا هابطًا فعالًا للجين المستهدف عند التهجين مع الحمض النووي الريبي الصغير المحدد في اليوم الأول واليوم الرابع بعد العزل.وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا التي تُصاب بـ "ميكرورنا" زيادة في التعبير عن ميكرورنا بمقدار 48 إلى 72 ضعفاً على الخلايا غير المنقولة بينما لا تظهر جميع عناصر التحكم في العدوى تغييرات ملموسة. عدد الخلايا مطلية أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. نوصي بمليون خلية لكل طبق 35 ملليمتر.سوف الطلاء في المتوسطة خالية من المصل أيضا إلى حد كبير تحسين مرفق الخلية. يمكن علاج الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة بالسيتوكينات أو عوامل النمو لدراسة الاستجابات التفاضلية في المرضى الذين ينهمون وضوابط صحية.

isolation-transfection-and-culture-of-primary-human-monocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates epithelial differentiation. There are many uses for this system. For instance, the ability to grow three-dimensional organotypic raft cultures of keratinocytes has been an important milestone in the study of human papillomavirus (HPV)1. The life cycle of HPV is tightly linked to the differentiation of squamous epithelium2. Organotypic epithelial raft cultures as demonstrated here reproduce the entire papillomavirus life cycle, including virus production3,4,5. In addition, these raft cultures exhibit dysplastic lesions similar to those observed upon in vivo infection with HPV. Hence this system can also be used to study epithelial cell cancers, as well as the effect of drugs on epithelial cell differentiation in general. Originally developed by Asselineau and Prunieras6 and modified by Kopan et al.7, the organotypic epithelial raft culture system has matured into a general, relatively easy culture model, which involves the growth of cells on collagen plugs maintained at an air-liquid interface (Figure 1A). Over the course of 10-14 days, the cells stratify and differentiate, forming a full thickness epithelium that produces differentiation-specific cytokeratins. Harvested rafts can be examined histologically, as well as by standard molecular and biochemical techniques. In this article, we describe a method for the generation of raft cultures from primary human keratinocytes. The same technique can be used with established epithelial cell lines, and can easily be adapted for use with epithelial tissue from normal or diseased biopsies8. Many viruses target either the cutaneous or mucosal epithelium as part of their replicative life cycle. Over the past several years, the feasibility of using organotypic raft cultures as a method of studying virus-host cell interactions has been shown for several herpesviruses, as well as adenoviruses, parvoviruses, and poxviruses9. Organotypic raft cultures can thus be adapted to examine viral pathogenesis, and are the only means to test novel antiviral agents for those viruses that are not cultivable in permanent cell lines.

An in vitro method to mimic in vivo epithelial differentiation is described. Many viruses target epithelial cells as part of their viral life cycle, and this method provides a means of examining virus:host interactions that more closely resembles that which occurs in vivo. This technique can be used with primary keratinocytes, established cell lines, as well as normal or diseased biopsy tissue.

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

الفأر والإنسان-المستمدة من الثقافة أساسي أحادي الطبقة الظهارية المعدة لدراسة تجديد

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...