Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

ويود المؤلفون ان يشكروا فيروس نقص المناعة البيولوجية/الأورام الحيوية النواة لتوفير عينات المريض والنواة الأيض المناعة الخلوية لتوفير تحليل تدفق الخلوي. تم تمويل هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة P20GM121288 و P30GM114732.

تمت الموافقة علي جميع الطرق الموضحة أدناه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لمركز نيو اورليانز للعلوم الصحية بجامعه ولاية لويزيانا. تم جمع جميع الدم بعد الحصول علي موافقه مستنيرة.
ملاحظه: يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في ظل ظروف معقمه في مرفق مستوي السلامة الاحيائيه 2 (BSL2) بحيث يتم ا?...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

ويبين البروتوكول المعروض استخدام الخلايا الاوليه من الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة الذاتية كنموذج لدراسة البويضات والضامات. فيروس نقص المناعة الذاتية + المرضي الذين يخضعون لعربه العيش مع العدوى لسنوات متعددة ، ويمكن أيضا ان يكون لها آخر العدوى المشتركة ذات الصلة جهاز المناعة...

تسبب عدوي فيروس نقص المناعة البشرية-1 (HIV-1) خللا مناعيا شديدا ، وهو ما يمكن ان يؤدي إلى الاصابه بالعدوى الانتهازية ومتلازمة عوز المناعة المكتسب (الإيدز). علي الرغم من ان المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة التي تمر بالعربة تتميز الأحمال الفيروسية المنخفضة والعد العادية الخلايا التائية + T ، ويمكن المساس بأداء الجهاز المناعي في هؤلاء الافراد ، مما يؤدي إلى استجابه مناعية مختلة التي ارتبطت بزيادة خطر الاصابه بالسرطان1 أليات الخلل المناعي في مرضي فيروس نقص المناعة الذاتية علي السلة لا تزال غير معروفه إلى حد كبير. ولذلك ، فان توصيف الخلايا المناعية المستمدة من المريض والتحقيق في علم الاحياء والوظيفة عنصر حاسم في البحوث الحالية بفيروس نقص المناعة المكتسب.
الخلايا الاحاديه والضامة هي المنظمين الرئيسيين للاستجابات المناعية وتلعب أدوارا أساسيه في الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية2,3,4,5. غير متجانسة والبلاستيك في الطبيعة ، ويمكن تصنيف الضامة علي نطاق واسع في تنشيط كلاسيكي (M1) أو بدلا من ذلك تنشيط (M2). في حين ان هذا التصنيف العام ضروري عند اعداد الشروط التجريبية ، قد يتم عكس حاله الاستقطاب من الضامة من قبل مجموعه متنوعة من السايتوكينات6،7،8،9. علي الرغم من ان العديد من الدراسات قد حققت في اثار الاصابه بفيروس نقص المناعة الذاتية علي الخلايا الاحاديه والجذعية ، والتفاصيل الجزيئية للاستجابات بوساطة البويضات غير معروفه إلى حد كبير6،7،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19 من بين العوامل التي تنطوي عليها تنظيم الخلايا المناعية ووظيفتها ، ميكرورناس (miRNAs) ، قصيرة غير الترميز RNAs ان ما بعد الهيستونات تنظيم التعبير الجيني ، وقد ثبت ان تلعب دورا هاما في سياق المسارات الخلوية الرئيسية (اي النمو ، والتمايز ، والتنمية ، والمبرمج)20. وقد وصفت هذه الجزيئات بأنها منظمات هامه من عوامل النسخ الاساسيه لإملاء الاستقطاب وظيفية من الضامة21. وقد تم التحقيق في الدور المحتمل لmirnas في الخلايا الاحاديه من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق ، ولكن التقدم في هذا المجال يتطلب المزيد من العمل22،23،24،25،26. تناقش هذه الورقة طريقه محسنه لتحويل miRNAs و siRNAs إلى خلايا بشريه أساسيه من المرضي المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية والضوابط.
يعتمد هذا البروتوكول علي الكواشف ومجموعات المواد المتاحة تجاريا ، لان الاستمرارية في الإجراءات التقنية تساعد علي أزاله المتغيرات التجريبية غير الضرورية عند العمل مع العينات السريرية. ومع ذلك ، فان الطريقة توفر نصائح هامه (اي عدد الخلايا المطلية أو الحاضنة القصيرة مع وسائل الاعلام الخالية من المصل لتعزيز التصاق الخلايا بالصفيحة). الاضافه إلى ذلك ، فان شروط الاستقطاب المستخدمة في هذا البروتوكول مستمده من الاعمال المنشورة27و28و29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

ولا يزال فيروس نقص المناعة البشرية أحد الشواغل الصحية الرئيسية علي الرغم من إدخال العلاج المضاد للفيروسات العكوسه في منتصف التسعينيات من القرن العشرين. في حين ان العلاج المضاد للفيروسات الرجعية يخفض بكفاءة الحمل الفيروسي الجهازي ويستعيد العد الطبيعي للخلاياالتائية ، فانه لا يعيد تشكيل جهاز مناعي وظيفي تماما. يمكن ان يتميز جهاز المناعة المختل في الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة الذين يخضعون لعربه التسوق بالتنشيط المناعي ، والشيخوخة المبكرة للخلايا المناعية ، أو التهاب المستمر. وتضيف هذه الشروط ، إلى جانب العوامل المصاحبة للاصابه بالفيروس ، تعقيدا إلى المرض ، الذي لا يمكن استنساخه بسهوله في النماذج الخلوية والحيوانية. للتحقيق في الاحداث الجزيئية الكامنة وراء الخلل المناعي في هؤلاء المرضي ، يتم عرض نظام للثقافة والتلاعب بالخلايا الوحيدة الاساسيه البشرية في المختبر هنا. وعلي وجه التحديد ، يسمح البروتوكول للثقافة والانتقال من CD14 الابتدائية + مونوسيدات التي تم الحصول عليها من الافراد المصابين بفيروس نقص المناعة المكتسب الذين يخضعون لعربه التسوق وكذلك من الضوابط السلبية لفيروس نقص المناعة المكتسب. وتشمل هذه الطريقة العزلة والثقافة والانتقال من الخلايا الاحاديه والضامة المشتقة من البويضات. في حين يتم استخدام مجموعات المتاحة تجاريا والكواشف, البروتوكول يوفر نصائح هامه والظروف المثلي للانضمام الناجحة والانتقال من الخلايا الاحاديه مع محاكاة ميرنا ومثبطات وكذلك مع siRNAs.

وباستخدام الاجراء الموصوف ، تم عزل الخلايا البشرية الاوليه من الافراد المصابين بالفيروس والمتبرعين الأصحاء. تم الحصول علي جميع البيانات المعروضة هنا من فيروس نقص المناعةالمكتسب + الموضوعات التي تخضع لعربه مع منخفضه (< 20 نسخ/مل) أو الأحمال الفيروسية غير قابل للكشف و...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

المعروض هنا هو بروتوكول الأمثل لعزل ، والزراعة ، ونقل ، والتفريق بين الخلايا الاساسيه البشرية من الافراد المصابين بالفيروس والضوابط الصحية.

العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

وتسبب الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية خللاً في المناعة حتى لدى الأفراد الذين يخضعون للعلاج المضاد للفيروسات العكوسة دون وجود فيروس يمكن اكتشافه. هذه الطريقة تسمح لدراسة وظيفة أحادية التي هي المنظمين الرئيسية للاستجابة المناعية. لقد قمنا بتحسين هذه التقنية لعزلة وثقافة وtransfection من أحاديات الإنسان الأولية.نحن نستخدم هذه الطريقة لفهم الآليات الجزيئية للخلل المناعي لدى الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية ، ولكن يمكن تطبيقها على أي دراسات مناعية أخرى تتضمن الخلايا الأحادية. إذا كانت هذه هي المرة الأولى التي تعمل فيها مع الدم البشري، فتذكر أن تتبع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة وأن تعامل جميع العينات على أنها مواد معدية. بعد جمع 40 ملليلتر من الدم البشري الكامل الطازج في أربعة 10 ملليلتر EDTA أنابيب فراغ، واستخدام تقنية معقمة لنقل كل من الدم في أنبوب بروبيلين مخروطي 50 ملليلتر واحد في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.بعد تعليمات الشركة المصنعة من مجموعة العزل أحادية الإنسان المحدد، إضافة ملليلترين من كوكتيل العزل أحادية من عدة إلى أنبوب الدم ودوامة الخرز المغناطيسي من عدة لمدة 30 ثانية. إضافة ملليلترين من الخرز إلى الدم واستخدام ماصة المصلية 25 ملليلتر لخلط بعناية الخرز مع الدم. بعد خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتقسيم الدم بالتساوي بين أربعة أنابيب 50 ملليلتر وإضافة 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم تكملها EDTA ملليمولار واحد إلى كل أنبوب.تخلط مرة أخرى مع ماصة بلاستيكية 25 ملليلتر المصلية ووضع الأنابيب في حاملات المغناطيسي. بعد 10 دقائق، واستخدام ماصة لرسم محتويات من وسط كل أنبوب مع الحرص على عدم التعرق أكثر من ملليلتر من خلايا الدم الحمراء والاستغناء عن محتويات الأنبوب في واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. أضف 500 ميكرولترات إضافية من الخرز المغناطيسي الدوامة إلى كل أنبوب وخلط بلطف حل الخلية.ضع الأنابيب مرة أخرى في الاقحام المغناطيسي لمدة خمس دقائق قبل نقل المحتويات بعناية من وسط كل أنبوب إلى واحدة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. عندما تم نقل جميع تعليق الخلية، ضع كل أنبوب 50 ملليلتر جديد في حاملات المغناطيس لمدة خمس دقائق قبل نقل محتويات الأنبوب بعناية إلى مجموعة ثالثة من أربعة أنابيب 50 ملليلتر جديدة. ثم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق جميع الكريات الخلية الأربعة في ما مجموعه 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيمة للعد.بعد عد, resuspend أحادية معزولة في مرة واحدة 10 إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر من 37 درجة مئوية الدم 1640 المتوسطة خالية من المصل تكملها المضادات الحيوية وطبقة ملليلتر واحد من الخلايا resuspended في 35 ملليمتر لوحات في مجلس الوزراء السلامة الحيوية. ثم ضع اللوحات في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 30 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بالتمسك بأسفل البئر. إلى رئيس ل الضامة مع نمط ظاهري يشبه M1 ، إضافة 100 ميكرولتر من مصل البقر الجنينية التي تحتوي على 25 نانوغرام لكل ملليلتر من GM-CSF إلى كل لوحة.إلى رئيس للضامة مع نمط ظاهري يشبه M2 ، أضف 100 ميكرولتر من الأبقار الجنينية التي تحتوي على 50 نانوغرام لكل ملليلتر من M-CSF إلى كل لوحة. بالنسبة لtransfection أحادية مع ميكرورنا تقليد، مثبطات، أو الحمض النووي الريبي التدخلي الصغيرة، بعد بروتوكول الشركة المصنعة لمجموعة transfection، تمييع الحمض النووي الريبي المختار في المخزن المؤقت إلى تركيز نهائي من 1.83 ميكرومولار في 10 ميكرولترات من تقليد المخفف أو لكل مثبطات من مرة واحدة 10 إلى حجم الخلايا الخامسة. لإعداد كاشف transfection ، إضافة ميكرولتر واحد من البوليمر المقدمة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ، وعلى الفور إضافة 90 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقدمة عدة للحصول على ما مجموعه 91 ميكرولترات من كاشف لكل transfection.دوامة ريجنت لمدة ثلاث إلى خمس ثوان والماصات 90 ميكرولترات من حل transfection في أنبوب يحتوي على 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي المخفف. بعد خلط لطيف، احتضان الحل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة 100 ميكرولترات من مجمع transfection إلى بئر واحد من الخلايا. بعد أربع ساعات في 37 درجة مئوية، استبدال المتوسطة مع ثلاثة ملليلتر من المتوسط الكامل تحتوي على عامل النمو المناسب.في اليوم السادس من الثقافة، استبدل المستفحلين في الثقافة من ثقافات M1 بثلاثة ملليلترات متوسطة مكمّلة بمصل الأبقار الجنينية، والمضادات الحيوية، وليبوبوليكساكريد، وترفيرفيرون غاما واستبدلوا المستفحلين من ثقافات M2 بمصل بوفين الجنيني، والمضادات الحيوية، و M-CSF، وinterleukin-4. بعد 24 ساعة من الثقافة، اغسل كل لوحة من الضامة المنشطة مرتين مع برنامج تلفزيوني جديد لكل غسل. بالنسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبروتين، فإن الخلايا المرفقة مباشرة في اللوحات تسمح بجمع محتويات الخلايا المفرج عنها لتحليلها.لتحليل تدفق cytometric، فصل الخلايا مع اثنين من ملليمولار EDTA في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية قبل كشط الخلايا بلطف من قيعان لوحة للسماح جمعها في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر لتحليلها. هنا يتم عرض الرسوم البيانية التمثيلية لـ M1-تنشيط التحكم والخلايا المشتقة من المريض مع زيادة مستويات الخلايا CD80 و CD83-تنشيط M2 مع زيادة مستويات CD163 و CD209 بالمقارنة مع الخلايا T0 غير المنشط. ومن المثير للاهتمام أن CD80 و CD83 يبدو أن أكثر تعبيراً في الخلايا المشتقة من التحكم مقارنة بالخلايا المشتقة من فيروس نقص المناعة البشرية.إن نقل الخلايا الأحادية التي تم جمعها حديثًا مع ميكرورنا المُعَدَّد من الأشعة تحت الحمراء المُشوشة التي تحمل اسم ميكرورنا يؤدي إلى زيادة كفاءة 90٪ من عمليات التنقّل على النحو الذي تحدده عملية استئصال الخلايا المتدفقة والمجهر المجهري. بالإضافة إلى ذلك، لا يقلل نقل الدم بشكل كبير من صلاحية الخلايا المشتقة من المريض أو السيطرة عليها بغض النظر عن مرحلة نضوج الخلايا أو ظروف النقل. ينتج عن عملية نقل الدرن تنظيمًا هابطًا فعالًا للجين المستهدف عند التهجين مع الحمض النووي الريبي الصغير المحدد في اليوم الأول واليوم الرابع بعد العزل.وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا التي تُصاب بـ "ميكرورنا" زيادة في التعبير عن ميكرورنا بمقدار 48 إلى 72 ضعفاً على الخلايا غير المنقولة بينما لا تظهر جميع عناصر التحكم في العدوى تغييرات ملموسة. عدد الخلايا مطلية أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة. نوصي بمليون خلية لكل طبق 35 ملليمتر.سوف الطلاء في المتوسطة خالية من المصل أيضا إلى حد كبير تحسين مرفق الخلية. يمكن علاج الخلايا التي تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة بالسيتوكينات أو عوامل النمو لدراسة الاستجابات التفاضلية في المرضى الذين ينهمون وضوابط صحية.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

جيل من الثقافات الطوافة عضوي النمط من الخلايا الكيراتينية الإنسان الأساسية

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

عزل حيدات الإنسان من مزدوجة التدرج الطرد المركزي والتمايز لالضامة في تفلون المغلفة حقائب خلية ثقافة

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ترنسفكأيشن كفاءة عالية من الإنسان THP-1 الضامة بواسطة Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...