Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke hiv-kliniske/tumor biorepositive kerne for at give patientprøver og cellulær immunologi metabolisme kerne for at give flow flowcytometri analyse. Dette projekt blev finansieret af NIH P20GM121288 og P30GM114732.

Alle metoder, der er beskrevet nedenfor, er blevet godkendt af Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutionel revisions tavle. Alt blod blev indsamlet efter at have indhentet informeret samtykke.
Bemærk: hele proceduren udføres under sterile forhold i et biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) anlæg, så forsigtighed anvendes til at håndtere biologiske materialer. Især udføres hvert trin ved hjælp af sterile teknikker under et biosikkerheds kabinet. Efter hvert trin, d...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Den præsenterede protokol viser brugen af primære celler fra HIV-inficerede forsøgspersoner som en model til at studere monocytter og makrofager. HIV+ patienter gennemgår cART lever med infektion i flere år og kan også have andre co-infektioner relateret et kompromitteret immunsystem. For at studere immunmodulerende i nærværelse af HIV kronisk infektion, celler blev høstet fra patienter direkte. Da miRNAs har vist sig at spille en større rolle i celle udvikling og differentiering, fokuserer protokoll...

Human immundefektvirus-1 (HIV-1) infektion forårsager alvorlig immun dysfunktion, hvilket kan føre til opportunistiske infektioner og erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Selv om HIV-inficerede patienter gennemgår cART er karakteriseret ved lav viral belastninger og normale CD4+ T celletal, funktion af immunsystemet kan blive kompromitteret i disse individer, fører til en dysfunktionel immunrespons, der har været forbundet med en øget risiko for at udvikle kræft1. Mekanismerne i immun dysfunktion hos HIV-patienter på vognen er stort set ukendte. Derfor er karakterisering af patient-afledte immunceller og undersøge deres biologi og funktion er en kritisk komponent i den nuværende HIV-forskning.
Monocytter og makrofager er centrale lovgivere af immunrespons og spille grundlæggende roller i hiv-infektion2,3,4,5. Heterogene og plast i naturen, kan makrofager bredt klassificeres i klassisk aktiveret (M1) eller alternativt aktiveret (m2). Denne generelle klassifikation er nødvendig ved opstilling af forsøgsbetingelser, men makro Fages polariserings status kan vendes af en række cytokiner6,7,8,9. Selv om flere undersøgelser har undersøgt virkningerne af hiv-infektion på monocytter og dendritiske celler, molekylære detaljer af monocyte-medierede svar er stort set ukendte6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Blandt de faktorer, der er involveret i immuncelle regulering og funktion, microRNAs (miRNAs), korte ikke-kodning RNAs at post-transkriptivt regulere genekspression, har vist sig at spille en vigtig rolle i forbindelse med større cellulære veje (dvs. vækst, differentiering, udvikling, og apoptose)20. Disse molekyler er blevet beskrevet som vigtige regulatorer af transkriptionsfaktorer, der er afgørende for at diktere den funktionelle polarisering af makrofager21. Den potentielle rolle Mirnas i monocytter fra HIV-inficerede personer gennemgår cART er blevet undersøgt, men fremskridt på området kræver meget mere arbejde22,23,24,25,26. Dette papir diskuterer en optimeret metode til transficere Mirnas og sirnas til primære humane monocytter fra HIV-inficerede patienter og kontrol.
Denne protokol er baseret på kommercielt tilgængelige reagenser og kits, da kontinuitet i den tekniske procedure hjælper med at eliminere unødvendige eksperimentelle variabler, når der arbejdes med kliniske prøver. Ikke desto mindre, metoden giver vigtige tips (dvs. antallet af celler belagt eller kort inkubation med serum-fri medier til at fremme tilslutningen af celler til pladen). Desuden er de polariserings betingelser, der anvendes i denne protokol, afledt af offentliggjort arbejde27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Humant immundefektvirus (HIV) er fortsat et stort sundhedsproblem på trods af indførelsen af kombineret antiretroviral terapi (cART) i midten af 1990 ' erne. Mens antiretroviral behandling effektivt sænker systemisk viral belastning og genopretter normale CD4+ T- celletal, er det ikke rekonstruere et helt funktionelt immunsystem. Et dysfunktionelt immunsystem i HIV-inficerede individer gennemgår cART kan være karakteriseret ved immun aktivering, tidlig aldring af immunceller, eller vedvarende inflammation. Disse betingelser, sammen med comorbiditet faktorer forbundet med HIV-infektion, tilføje kompleksitet til sygdommen, som ikke let kan gengives i cellulære og animalske modeller. For at undersøge de molekylære hændelser underliggende immun dysfunktion hos disse patienter, et system til kultur og manipulere menneskelige primære monocytter in vitro præsenteres her. Specifikt, protokollen giver mulighed for kultur og transfektering af primære CD14+ monocytter opnået fra HIV-inficerede personer gennemgår cART samt fra hiv-negative kontroller. Metoden involverer isolation, kultur og transfektering af monocytter og monocyt-afledte makrofager. Mens kommercielt tilgængelige kits og reagenser er ansat, protokollen giver vigtige tips og optimerede betingelser for vellykket overholdelse og transfektering af monocytter med Mirna efterligner og hæmmere samt med sirnas.

Ved hjælp af den beskrevne fremgangsmåde blev primære humane monocytter fra HIV-inficerede individer og raske donorer isoleret. Alle data, der præsenteres her, er indhentet fra HIV+- patienter, som gennemgår en kurv med lav (< 20 kopier/ml) eller ikke-detekterbare virale belastninger og normale CD4+ T- celletal. Umiddelbart efter isolation, celler blev farvet, og flow flowcytometri blev udført for at bekræfte renheden af cellepopulationer. Resultaterne viste, ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Præsenteret her er en optimeret protokol til isolering, culturing, transfficerende, og differentiere menneskelige primære monocytter fra HIV-inficerede individer og sunde kontroller.

Isolation, Transfection og kultur af primære humane monocytter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV-infektion forårsager immundysfunktion selv hos personer, der gennemgår antiretroviral behandling uden påviselig virus. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af monocyt funktion, som er centrale regulatorer af immunrespons. Vi har optimeret denne teknik til isolering, kultur og transinfektion af menneskets primære monocytter.Vi bruger denne metode til at forstå de molekylære mekanismer immun dysfunktion hos HIV-smittede personer, men det kan anvendes til alle andre immunundersøgelser, der involverer monocytter. Hvis dette er første gang, du arbejder med humant blod, skal du huske at følge de korrekte biosikkerhedsprotokoller og behandle alle prøverne som muligvis infektiøs materiale. Efter indsamling af 40 milliliter friskt humant fuldblod i fire 10 milliliter EDTA vakuumrør anvendes steril teknik til at overføre alt blodet til et enkelt 50 milliliter konisk propylenrør i et biosikkerhedsskab.Efter producentens anvisninger fra en udvalgt menneskelige monocyt isolation kit, tilføje to milliliter monocyt isolation cocktail fra sættet til røret af blod og vortex de magnetiske perler fra sættet i 30 sekunder. Tilføj to milliliter perler til blodet og brug en 25 milliliter serologisk pipette til omhyggeligt at blande perlerne med blodet. Efter fem minutter ved stuetemperatur opdeles blodet ligeligt mellem fire 50 milliliterrør, og der tilsættes 30 milliliter steril PBS suppleret med 1 millimolar EDTA til hvert rør.Bland igen med en plastik 25 milliliter serologisk pipette og læg rørene i magnetiske holdere. Efter 10 minutter skal der anvendes en pipette til at opbebyrde indholdet fra midten af hvert rør, idet der ikke aspireres mere end en milliliter røde blodlegemer, og rørindholdet skal dispenseres i et af de fire nye 50 milliliterrør. Tilsæt 500 ekstra mikroliter af de vortexed magnetiske perler til hvert rør og bland forsigtigt celleopløsningen.Rørerne anbringes tilbage i magnetholderne i fem minutter, før indholdet fra midten af hvert rør overføres omhyggeligt til et af de fire nye 50 milliliterrør. Når alle cellesuspensioner er blevet overført, anbringes hvert nyt 50 milliliterrør i magnetholderne i fem minutter, før rørindholdet overføres omhyggeligt til et tredje sæt af fire nye 50 milliliterrør. Cellerne opsamler derefter ved centrifugering og opslæmrer alle fire cellepiller i i alt 10 milliliter steril PBS til optælling.Efter optælling, resuspenderet de isolerede monocytter på en gange 10 til den sjette celler per milliliter af 37 grader Celsius serum-fri RPMI 1640 medium suppleret med antibiotika og plade en milliliter resuspenderede celler i 35 millimeter plader i en biosikkerhed kabinet. Placer derefter pladerne i cellekulturskuvøsen i 30 til 60 minutter for at give cellerne mulighed for at holde sig til brøndbunden. For at prime for makrofager med en M1-lignende fænotype tilsættes 100 mikroliter føtalt kvægserum, der indeholder 25 nanogram pr. milliliter GM-CSF, til hver plade.For at prime for makrofager med en M2-lignende fænotype tilsættes 100 mikroliter føtalt kvæg, der indeholder 50 nanogram pr. milliliter M-CSF, til hver plade. For monocyttransinfektion med mikroRNA-efterligner, hæmmere eller et lille forstyrrende RNA, fortyndes de valgte RNA'er i bufferen efter producentens protokol for transfektionssættet de valgte RNA'er i bufferen til en endelig koncentration på 1,83 mikromolar i 10 mikroliter fortyndet efterligner eller inhibitor pr. transfection på en gange 10 til det femte cellevolumen. For at forberede transfektion reagens, tilsæt en mikroliter af den medfølgende polymer til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør og straks tilføje 90 mikroliter af kit-forudsat buffer for at opnå i alt 91 mikrolitere reagens per transfektion.Vortex regenten i tre til fem sekunder og pipette 90 mikroliter af transfektionsopløsningen ind i røret, der indeholder 10 mikroliter fortyndet RNA. Efter skånsom blanding inkuberes opløsningen i 15 minutter ved stuetemperatur, før der tilsættes 100 mikroliter transfektionskompleks til en brønd af celler. Efter fire timer ved 37 grader Celsius erstattes mediet med tre milliliter komplet medium, der indeholder den relevante vækstfaktor.På kulturdag erstatter kultursupernatanterne fra M1-kulturerne med tre milliliter medium suppleret med føtalt kvægserum, antibiotika, lipopolysaccharid og interferongamma og erstatte supernatanterne fra M2-kulturerne med medium suppleret med føtalt kvægserum, antibiotika, M-CSF og interleukin-4. Efter 24 timers kultur vaskes hver plade af aktiverede makrofager to gange med frisk PBS pr. vask. Til RNA- og proteinanalyser skal de tilknyttede celler lyses direkte i pladerne for at gøre det muligt at opsamlinge det frigivne celleindhold til deres analyse.Til flowcytometrisk analyse skal cellerne løsnes med to millimolar EDTA i PBS i 10 minutter ved 37 grader Celsius, før cellerne forsigtigt skrabes fra pladebunden, så de kan blive opsamlinget i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør til deres analyse. Her vises repræsentative histogrammer af M1-aktiveret kontrol og patientafledte celler med forhøjede niveauer af CD80 og CD83 og M2-aktiverede celler med forhøjede niveauer af CD163 og CD209 sammenlignet med ikke-aktiverede T0-celler. Interessant, CD80 og CD83 syntes at være mere højt udtrykt i kontrol-afledte celler i forhold til HIV-afledte celler.Transinfektionen af friskindsamlet monocytter med et forvrænget nær-infrarødt mærket mikroRNA resulterer i en større end 90% effektivitet af transinfektion som bestemt af flow cytometri og konfokal mikroskopi. Desuden reducerer transinfektion ikke i væsentlig grad levedygtigheden af patientafledte celler eller kontrolceller uanset cellemodningsstadiet eller transinfektionsbetingelserne. Transfektion resulterer i en effektiv nedregulering af målgenet ved transinfektion med det specifikke lille forstyrrende RNA på både dag ét og dag fire efter isolation.Endvidere viser celler, der er transficeret med microRNA-efterligner, en 48 til 72 gange stigning i mikroRNA-ekspressionen over ikke-oversmittede celler, mens alle transfektionskontroller ikke viser nogen mærkbare ændringer. Antallet af belagte celler er afgørende for overlevelse. Vi anbefaler en million celler pr. 35 millimeter skål.Plating i serum-fri medium vil også i høj grad forbedre cellen vedhæftet fil. Celler, der er opnået med denne metode, kan behandles med cytokiner eller vækstfaktorer for at studere forskellige reaktioner hos patienter af interesse og sund kontrol.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Generering af Organotypiske Raft Cultures fra primære humane keratinocytter

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Ændring af primære humane T-celler

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering af humanmonocytter af Double Gradient centrifugering og deres differentiering til makrofager i teflonbelagte Cell Culture Tasker

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Stærkt Effektiv Transfektion af menneskelige THP-1 makrofager ved nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolation og intravenøs injektion af murine knoglemarv Afledte Monocytter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging af antifungal aktivitet af humane primære neutrofiler og monocytter i Reaktion på<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Lille RNA transfektion i primære humane Th17 Celler af Next Generation Elektroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...