Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

De auteurs willen de HIV klinische/tumor Biorepository kern bedanken voor het verstrekken van patiënt monsters en de cellulaire immunologie metabolisme kern voor het verstrekken van Flowcytometrie analyse. Dit project werd gefinancierd door NIH P20GM121288 en P30GM114732.

Alle hieronder beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans institutioneel Review Board. Al het bloed werd verzameld na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming.
Opmerking: de gehele procedure wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een faciliteit voor bioveiligheid niveau 2 (BSL2), zodat voorzichtigheid wordt gebruikt voor het omgaan met biologische materialen. In het bijzonder wordt elke stap uitgevoerd met behulp v...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Het gepresenteerde protocol toont het gebruik van primaire cellen van HIV-geïnfecteerde onderwerpen als een model voor het bestuderen van monocyten en macrofagen. HIV+ patiënten ondergaan kar leven met infectie voor meerdere jaren en kunnen ook andere co-infecties gerelateerd een gecompromitteerd immuunsysteem. Om immunomodulatie te bestuderen in de aanwezigheid van een chronische HIV-infectie, werden cellen rechtstreeks van patiënten geoogst. Aangezien miRNAs belangrijke rollen speelt in celontwikkeling en...

Humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1) infectie veroorzaakt ernstige immuundisfunctie, wat kan leiden tot opportunistische infecties en verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS). Hoewel HIV-geïnfecteerde patiënten die cART ondergaan worden gekenmerkt door lage virale belastingen en normale CD4+ T-celtellingen, kan de werking van het immuunsysteem in deze individuen worden aangetast, wat leidt tot een disfunctionele immuunrespons die is gekoppeld aan een verhoogd risico op het ontwikkelen van kanker1. De mechanismen van immuun disfunctie bij HIV-patiënten in de winkelwagen blijven grotendeels onbekend. Daarom is het karakteriseren van patiënt afkomstige immuuncellen en het onderzoeken van hun biologie en functie een essentieel onderdeel van het huidige HIV-onderzoek.
Monocyten en macrofagen zijn belangrijke regulatoren van immuunresponsen en spelen fundamentele rollen bij HIV-infectie2,3,4,5. Heterogene en kunststof in de natuur, macrofagen kunnen breed worden geclassificeerd in klassiek geactiveerde (M1) of als alternatief geactiveerd (m2). Hoewel deze algemene indeling nodig is bij het instellen van experimentele omstandigheden, kan de polarisatie status van macrofagen worden omgekeerd door een verscheidenheid van cytokines6,7,8,9. Hoewel verschillende studies de effecten van HIV-infectie op monocyten en dendritische cellen hebben onderzocht, zijn de moleculaire Details van monocyte-gemedieerde reacties grotendeels onbekend6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Onder de factoren die betrokken zijn bij de regulering en functie van immuun cellen, microRNAs (miRNAs), korte niet-Codeer Rna's die na transcriptioneel de genexpressie reguleren, is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in de context van belangrijke cellulaire trajecten (d.w.z. groei, differentiatie, ontwikkeling en apoptosis)20. Deze moleculen zijn beschreven als belangrijke regulatoren van transcriptiefactoren die essentieel zijn voor het diceren van de functionele polarisatie van macrofagen21. De mogelijke rol van miRNAs in monocyten van HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan is onderzocht, maar vooruitgang in het veld vereist veel meer werk22,23,24,25,26. Deze paper bespreekt een geoptimaliseerde methode om miRNAs en siRNAs te transfect in primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde patiënten en controles.
Dit protocol is gebaseerd op in de handel verkrijgbare reagentia en kits, omdat de continuïteit in de technische procedure helpt bij het elimineren van onnodige experimentele variabelen bij het werken met klinische monsters. Niettemin, de methode biedt belangrijke tips (dat wil zeggen, het aantal cellen verguld of korte incubatie met serum vrije media om de hechting van cellen aan de plaat te bevorderen). Bovendien zijn de in dit Protocol gebruikte polarisatie omstandigheden afgeleid van het gepubliceerde werk27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Humaan immunodeficiëntie virus (HIV) blijft een belangrijke gezondheidszorg ondanks de introductie van gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) in het midden van de jaren 1990. Hoewel antiretrovirale therapie de systemische virale belasting efficiënt verlaagt en het normale aantal CD4+ T-cellen herstelt, vormt het geen volledig functioneel immuunsysteem. Een disfunctioneel immuunsysteem in HIV-geïnfecteerde personen die kar ondergaan kan worden gekenmerkt door immuun activering, vroege veroudering van immune cellen, of aanhoudende ontsteking. Deze voorwaarden, samen met comorbide factoren die gepaard gaan met HIV-infectie, voegen complexiteit toe aan de ziekte, die niet gemakkelijk kan worden gereproduceerd in cellulaire en dierlijke modellen. Om te onderzoeken van de moleculaire gebeurtenissen onderliggende immuundisfunctie bij deze patiënten, een systeem voor cultuur en manipuleren van menselijke primaire monocyten in vitro wordt hier gepresenteerd. Specifiek, het protocol maakt het mogelijk voor de cultuur en transfectie van primaire CD14+ monocyten verkregen van HIV-geïnfecteerde personen die kar en HIV-negatieve controles ondergaan. De methode omvat isolatie, cultuur en transfectie van monocyten en monoyte-afgeleide macrofagen. Terwijl in de handel verkrijgbare kits en reagentia worden gebruikt, biedt het protocol belangrijke tips en geoptimaliseerde voorwaarden voor een geslaagde hechting en transfectie van monocyten met Mirna bootst en remmers, evenals met sirna's.

Met behulp van de beschreven procedure werden primaire humane monocyten van HIV-geïnfecteerde personen en gezonde donoren geïsoleerd. Alle hier gepresenteerde gegevens werden verkregen van HIV+ -proefpersonen die een kar ondergingen met een lage (< 20 kopieën/ml) of niet-detecteerbare virale ladingen en normale CD4+ T-cellen. Onmiddellijk na isolatie, cellen werden gekleurd, en flow cytometrie werd uitgevoerd om te bevestigen van de zuiverheid van de celpopulaties...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV-infectie veroorzaakt immuundisfunctie, zelfs bij personen die antiretrovirale therapie ondergaan zonder detecteerbaar virus. Deze methode maakt het mogelijk voor de studie van monocyten functie die belangrijke regelgevers van de immuunrespons. We hebben deze techniek geoptimaliseerd voor de isolatie, cultuur en transfectie van menselijke primaire monocyten.We gebruiken deze methode om de moleculaire mechanismen van immuundisfunctie bij hiv-geïnfecteerde personen te begrijpen, maar het kan worden toegepast op andere immuunstudies met monocyten. Als dit de eerste keer is dat u met menselijk bloed werkt, vergeet dan niet om de juiste bioveiligheidsprotocollen te volgen en alle monsters te behandelen als mogelijk besmettelijk materiaal. Na het verzamelen van 40 milliliter vers menselijk volbloed in vier edta vacuümbuizen van 10 milliliter, gebruik steriele techniek om al het bloed in één 50 milliliter conische propyleenbuis in een bioveiligheidskast over te brengen.Voeg volgens de instructies van de fabrikant van een geselecteerde menselijke monocyten isolatiekit twee milliliter monocyten isolatiecocktail toe van de kit aan de buis van bloed en vortex de magnetische kralen uit de kit gedurende 30 seconden. Voeg twee milliliter kralen toe aan het bloed en gebruik een serologische pipet van 25 milliliter om de kralen zorgvuldig met het bloed te mengen. Na vijf minuten bij kamertemperatuur, split het bloed even tussen vier 50 milliliter buizen en voeg 30 milliliter steriele PBS aangevuld met een millimolar EDTA aan elke buis.Meng opnieuw met een plastic 25 milliliter serologische pipet en plaats de buizen in magnetische houders. Gebruik na 10 minuten een pipet om de inhoud uit het midden van elke buis op te stellen en zorg ervoor te zorgen dat u niet meer dan één milliliter rode bloedcellen aanzuit en de buisinhoud in een van de vier nieuwe 50 milliliterbuizen af te geven. Voeg 500 extra microliter van de vortexed magnetische kralen toe aan elke buis en meng voorzichtig de celoplossing.Plaats de buizen terug in de magnetische houders gedurende vijf minuten alvorens zorgvuldig de inhoud van het midden van elke buis in een van de vier nieuwe 50 milliliter buizen. Wanneer alle celsuspensies zijn overgedragen, plaatst u elke nieuwe buis van 50 milliliter gedurende vijf minuten in de magneethouders voordat u de buisinhoud zorgvuldig overzet in een derde set van vier nieuwe buizen van 50 milliliter. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en resuspend alle vier celpellets in een totaal van 10 milliliter steriele PBS voor het tellen.Na het tellen, resuspend de geïsoleerde monocyten op een keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van 37 graden Celsius serum-vrije RPMI 1640 medium aangevuld met antibiotica en plaat een milliliter van geresuspendeerde cellen in 35 millimeter platen in een biosafety kabinet. Plaats vervolgens de platen in de celcultuur incubator voor 30 tot 60 minuten om de cellen te houden aan de put bodems. Voeg 100 microliter foetale runderserum met 25 nanogram per milliliter GM-CSF toe aan elke plaat om te primeren voor macrofagen met een M1-achtig fenotype.Om te primeren voor macrofagen met een M2-achtig fenotype, voeg 100 microliter foetale runderen met 50 nanogram per milliliter M-CSF aan elke plaat toe. Voor monocyte transfectie met microRNA bootst, remmers, of een kleine storende RNA, volgens het protocol van de fabrikant voor de transfectie kit, verdun de geselecteerde RNAs in de buffer tot een uiteindelijke concentratie van 1,83 micromolar in 10 microliter van verdunde nabootsing of remmer per transfectie van een keer 10 tot het vijfde cellenvolume. Om het transfectiereagens op te bereiden, voegt u een microliter van het meegeleverde polymeer toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voegt u onmiddellijk 90 microliter van de door de kit geleverde buffer toe om in totaal 91 microliter reagens per transfectie te verkrijgen.Vortex de regent gedurende drie tot vijf seconden en pipet 90 microliters van de transfectieoplossing in de buis met 10 microliter van verdund RNA. Na het zachte mengen, incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur alvorens 100 microliters van transfectiecomplex toe te voegen aan een put van cellen. Na vier uur bij 37 graden Celsius, vervang het medium met drie milliliter van volledig medium met de juiste groeifactor.Vervang op dag zes van de cultuur de kweeksupernatants uit de M1-culturen door drie milliliter medium aangevuld met foetale runderserum, antibiotica, lipopolysaccharide, en interferon gamma en vervang de supernatants uit de M2-culturen door medium aangevuld met foetaal runderserum, antibiotica, M-CSF en interleukine-4. Na 24 uur cultuur, was elke plaat van geactiveerde macrofagen twee keer met verse PBS per wasbeurt. Voor RNA- en eiwitanalyses lyse de bijgevoegde cellen direct in de platen om het verzamelen van de vrijgekomen celinhoud voor hun analyse mogelijk te maken.Voor flow cytometrische analyse, los de cellen met twee millimolar EDTA in PBS gedurende 10 minuten op 37 graden Celsius voordat voorzichtig schrapen van de cellen van de plaat bodems om hun verzameling in 1,5 milliliter microcentrifuge buizen voor hun analyse. Hier representatieve histogrammen van M1-geactiveerde controle en patiënt-afgeleide cellen met verhoogde niveaus van CD80 en CD83 en M2-geactiveerde cellen met verhoogde niveaus van CD163 en CD209 in vergelijking met niet-geactiveerde T0 cellen worden getoond. Interessant is dat CD80 en CD83 meer uitgedrukt bleken te zijn in door de controle afgeleide cellen in vergelijking met hiv-afgeleide cellen.De transfectie van vers verzamelde monocyten met een gecodeerde nabij-infrarood gelabelde microRNA resulteert in een meer dan 90% efficiëntie van transfectie zoals bepaald door flow cytometrie en confocale microscopie. Bovendien vermindert transfectie de levensvatbaarheid van door de patiënt afgeleide of controlecellen niet significant, ongeacht het stadium van celrijping of de transfectieomstandigheden. Transfectie resulteert in een effectieve downregulatie van het doelgen bij transfectie met het specifieke kleine storende RNA op zowel dag één als dag vier na isolatie.Verder, cellen doorgetast met microRNA na te bootsen tonen een 48 tot 72-voudige toename van microRNA expressie over onvervangde cellen, terwijl alle van de transfectie controles tonen geen aanzienlijke veranderingen. Het aantal vergulde cellen is cruciaal om te overleven. Wij raden een miljoen cellen per 35 millimeter schotel.Plating in serum-vrij medium zal ook sterk verbeteren van de cel bevestiging. Cellen verkregen met deze methode kunnen worden behandeld met cytokines of groeifactoren om differentiële reacties bij patiënten van belang en gezonde controles te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon Systeem Wijziging van primaire menselijke T-cellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolatie van humane monocyten door Double gradiëntcentrifugering en hun differentiatie tot macrofagen in Teflon-coating Cell Culture Tassen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Zeer efficiënte transfectie van Human THP-1 macrofagen door Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolatie en intraveneuze injectie van muizen beenmerg afgeleide Monocyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live-Imaging van antischimmelactiviteit door Human Primary neutrofielen en monocyten in reactie op<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Small RNA Transfectie in primaire humane Th17 cellen door Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...