Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
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Les auteurs aimeraient remercier le noyau de biorepository clinique/tumoral du VIH d'avoir fourni des échantillons de patients et le noyau de métabolisme d'immunologie cellulaire pour fournir l'analyse de cytométrie de flux. Ce projet a été financé par NIH P20GM121288 et P30GM114732.

Toutes les méthodes décrites ci-dessous ont été approuvées par le Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tout le sang a été recueilli après avoir obtenu le consentement éclairé.
REMARQUE : L'ensemble de la procédure est effectué dans des conditions stériles dans une installation de biosécurité de niveau 2 (BSL2) afin que la prudence soit utilisée pour manipuler les matériaux biologiques. En particulier, chaque étape est effec...

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	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Le protocole présenté démontre l'utilisation de cellules primaires de sujets infectés par le VIH comme modèle pour l'étude des monocytes et des macrophages. Les patients atteints de VIHet de coart vivent avec une infection pendant plusieurs années et peuvent également avoir d'autres co-infections liées à un système immunitaire compromis. Pour étudier l'immunomodulation en présence d'une infection chronique par le VIH, des cellules ont été prélevées directement sur des patients. Comme il a ét?...

L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine 1 (VIH-1) provoque un dysfonctionnement immunitaire grave, qui peut entraîner des infections opportunistes et le syndrome d'immunodéficience acquise (sida). Bien que les patients infectés par le VIH qui subissent une multithérapie soient caractérisés par de faibles charges virales et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T, le fonctionnement du système immunitaire peut être compromis chez ces personnes, ce qui entraîne une réponse immunitaire dysfonctionnelle qui a été associée à un risque accru de développer un cancer1. Les mécanismes de dysfonctionnement immunitaire chez les patients séropositifs sous la cothérapie demeurent largement inconnus. Par conséquent, caractériser les cellules immunitaires d'origine du patient et étudier leur biologie et leur fonction est un élément essentiel de la recherche actuelle sur le VIH.
Les monocytes et les macrophages sont des régulateurs clés des réponses immunitaires et jouent un rôle fondamental dans l'infection par le VIH2,3,4,5. Hétérogènes et plastiques de nature, les macrophages peuvent être largement classés en activéclassiquement (M1) ou alternativement activés (M2). Bien que cette classification générale soit nécessaire lors de la mise en place de conditions expérimentales, le statut de polarisation des macrophages peut être inversé par une variété de cytokines6,7,8,9. Bien que plusieurs études aient étudié les effets de l'infection par le VIH sur les monocytes et les cellules dendritiques, les détails moléculaires des réponses monocytes-négociées sont en grande partie inconnus6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Parmi les facteurs impliqués dans la régulation et la fonction des cellules immunitaires, il a été démontré que les microARN (miARN) courts et non codants qui régulent l'expression des gènes après la transcription, jouent un rôle important dans le contexte des principales voies cellulaires (c.-à-d. la croissance, la différenciation, le développement et l'apoptose)20. Ces molécules ont été décrites comme d'importants régulateurs de facteurs de transcription essentiels pour dicter la polarisation fonctionnelle des macrophages21. Le rôle potentiel des miARN dans les monocytes des personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie a été étudié, mais les progrès dans le domaine exigent beaucoup plus de travail22,23,24,25,26. Cet article traite d'une méthode optimisée pour transfect miRNAs et siRNAs dans les monocytes humains primaires des patients et des contrôles HIV-infectés.
Ce protocole repose sur des réactifs et des kits disponibles dans le commerce, car la continuité de la procédure technique permet d'éliminer les variables expérimentales inutiles lorsqu'on travaille avec des échantillons cliniques. Néanmoins, la méthode fournit des conseils importants (c.-à-d., le nombre de cellules plaquées ou une brève incubation avec des médias sans sérum pour favoriser l'adhérence des cellules à la plaque). En outre, les conditions de polarisation utilisées dans ce protocole sont dérivées de l'ouvrage publié27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) demeure un problème de santé majeur malgré l'introduction d'un traitement antirétroviral combiné (coART) au milieu des années 1990. Bien que la thérapie antirétrovirale abaisse efficacement la charge virale systémique et rétablisse le nombre normal de cD4et de lymphocytes T, elle ne reconstitue pas un système immunitaire complètement fonctionnel. Un système immunitaire dysfonctionnel chez les personnes infectées par le VIH subissant une multithérapie peut être caractérisé par une activation immunitaire, un vieillissement précoce des cellules immunitaires ou une inflammation persistante. Ces conditions, ainsi que les facteurs comorbides associés à l'infection par le VIH, ajoutent de la complexité à la maladie, qui ne peut pas être facilement reproduite dans les modèles cellulaires et animaux. Pour étudier les événements moléculaires sous-jacents au dysfonctionnement immunitaire dans ces patients, un système à la culture et manipuler les monocytes primaires humains in vitro est présenté ici. Plus précisément, le protocole permet la culture et la transfection des monocytes CD14 primaires obtenus auprès de personnes infectées par le VIH qui subissent une multithérapie ainsi que de contrôles séronégatifs. La méthode implique l'isolement, la culture et la transfection des monocytes et des macrophages dérivés de monocytes. Tandis que des kits et des réactifs disponibles dans le commerce sont employés, le protocole fournit des bouts importants et des conditions optimisées pour l'adhérence réussie et la transfection des monocytes avec des imitations et des inhibiteurs de miRNA aussi bien qu'avec des siRNAs.

À l'aide de la procédure décrite, les monocytes humains primaires provenant de personnes infectées par le VIH et de donneurs en bonne santé ont été isolés. Toutes les données présentées ici ont été obtenues à partir desujets séropositifs et soumis à une multithérapie avec des charges virales faibles (lt;20 copies/mL) ou indétectables et des numérations normales de CD4et de lymphocytes T. Immédiatement après l'isolement, les cellules ont été sou...

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Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Présenté ici est un protocole optimisé pour isoler, cultiver, transfecter, et différencier les monocytes primaires humains des individus infectés par le VIH et des contrôles sains.

Isolement, transfection et culture des monocytes humains primaires

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

L’infection par le VIH provoque un dysfonctionnement immunitaire même chez les personnes qui suivent un traitement antirétroviral sans virus détectable. Cette méthode permet l’étude de la fonction monocyte qui sont les régulateurs clés de la réponse immunitaire. Nous avons optimisé cette technique pour l’isolement, la culture et la transfection des monocytes primaires humains.Nous utilisons cette méthode pour comprendre les mécanismes moléculaires du dysfonctionnement immunitaire chez les personnes infectées par le VIH, mais elle peut être appliquée à toute autre étude immunitaire impliquant des monocytes. Si c’est la première fois que vous travaillez avec du sang humain, n’oubliez pas de suivre les protocoles de biosécurité appropriés et de traiter tous les échantillons comme des matériaux potentiellement infectieux. Après avoir recueilli 40 millilitres de sang entier humain frais dans quatre tubes à vide EDTA de 10 millilitres, utilisez une technique stérile pour transférer tout le sang dans un seul tube conique de propylène de 50 millilitres dans une armoire de biosécurité.Suivant les instructions du fabricant à partir d’un kit d’isolation des monocytes humains sélectionnés, ajoutez deux millilitres de cocktail d’isolation monocyte du kit au tube de sang et vortex les perles magnétiques du kit pendant 30 secondes. Ajouter deux millilitres de perles dans le sang et utiliser une pipette sérologique de 25 millilitres pour mélanger soigneusement les perles avec le sang. Après cinq minutes à température ambiante, diviser le sang également entre quatre tubes de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de PBS stérile complété par un millimolaire EDTA à chaque tube.Mélanger à nouveau avec une pipette sérologique en plastique de 25 millilitres et placer les tubes dans des supports magnétiques. Après 10 minutes, utiliser une pipette pour dessiner le contenu à partir du centre de chaque tube en prenant soin de ne pas aspirer plus d’un millilitre de globules rouges et de distribuer le contenu du tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Ajouter 500 microlitres supplémentaires des perles magnétiques vortexées à chaque tube et mélanger délicatement la solution cellulaire.Remettre les tubes dans les supports magnétiques pendant cinq minutes avant de transférer soigneusement le contenu du centre de chaque tube dans l’un des quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Lorsque toutes les suspensions cellulaires ont été transférées, placez chaque nouveau tube de 50 millilitres dans les porte-aimants pendant cinq minutes avant de transférer soigneusement le contenu du tube dans un troisième ensemble de quatre nouveaux tubes de 50 millilitres. Puis recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre les quatre granulés cellulaires dans un total de 10 millilitres de PBS stérile pour le comptage.Après comptage, resuspendez les monocytes isolés à une fois 10 aux sixièmes cellules par millilitre de 37 degrés Celsius sans sérum RPMI 1640 moyen complété avec des antibiotiques et plaque un millilitre de cellules résuspendues dans des plaques de 35 millimètres dans une armoire de biosécurité. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 à 60 minutes pour permettre aux cellules d’adhérer au fond du puits. Pour commencer pour les macrophages avec un phénotype de type M1, ajouter 100 microlitres de sérum bovin fœtal contenant 25 nanogrammes par millilitre de GM-CSF à chaque plaque.Pour prier les macrophages avec un phénotype de type M2, ajoutez 100 microlitres de bovins fœtaux contenant 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF à chaque plaque. Pour la transfection monocyte avec des imitations de microARN, inhibiteurs, ou un petit ARN interférant, suivant le protocole du fabricant pour le kit de transfection, diluer les ARN sélectionnés dans le tampon à une concentration finale de 1,83 micromolaire dans 10 microlitres d’imitation diluée ou inhibiteur par transfection d’une fois 10 au volume des cellules cinquième. Pour préparer le réaccente de transfection, ajouter un microlitre du polymère fourni à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajouter immédiatement 90 microlitres du tampon fourni par kit pour obtenir un total de 91 microlitres de réaccente par transfection.Vortex le régent pendant trois à cinq secondes et pipette 90 microlitres de la solution de transfection dans le tube contenant 10 microlitres d’ARN dilué. Après un mélange doux, incuber la solution pendant 15 minutes à température ambiante avant d’ajouter 100 microlitres de teint transfection à un puits de cellules. Après quatre heures à 37 degrés Celsius, remplacer le milieu par trois millilitres de milieu complet contenant le facteur de croissance approprié.Le sixième jour de la culture, remplacer les supernatants de culture des cultures M1 par trois millilitres de milieu complétés par du sérum bovin fœtal, des antibiotiques, du lipopolysaccharide et de l’interféron gamma et remplacer les supernatants des cultures M2 par un sérum bovin fœtal, des antibiotiques, du M-CSF et de l’interleukine-4. Après 24 heures de culture, lavez chaque assiette de macrophages activés deux fois avec du PBS frais par lavage. Pour les analyses d’ARN et de protéines, lyse les cellules attachées directement dans les plaques pour permettre la collecte du contenu cellulaire libéré pour leur analyse.Pour l’analyse cytométrique d’écoulement, détachez les cellules avec deux millimolar EDTA dans PBS pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius avant de racler doucement les cellules du fond de plaque pour permettre leur collecte dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour leur analyse. Ici, des histogrammes représentatifs de cellules de contrôle activées par M1 et de cellules dérivées du patient avec des niveaux accrus de cellules CD80 et CD83 et M2 activées avec des niveaux accrus de CD163 et CD209 par rapport aux cellules T0 non activées sont montrés. Fait intéressant, le CD80 et le CD83 semblaient être plus fortement exprimés dans les cellules dérivées du contrôle que dans les cellules dérivées du VIH.La transfection des monocytes fraîchement rassemblés avec un microARN étiqueté proche infrarouge brouillé a comme conséquence une plus grande efficacité de plus de 90% de transfection telle que déterminée par la cytométrie d’écoulement et la microscopie confocale. En outre, la transfection ne réduit pas significativement la viabilité des cellules dérivées du patient ou de contrôle, quel que soit le stade de maturation cellulaire ou les conditions de transfection. La transfection entraîne une downregulation efficace du gène cible lors de la transfection avec le petit ARN interférant spécifique au premier jour et au quatrième jour après l’isolement.En outre, les cellules transfectées avec l’imitation de microARN démontrent une augmentation de 48 à 72 fois de l’expression de microARN au-dessus des cellules nontransfectées tandis que tous les contrôles de transfection ne montrent aucun changement appréciable. Le nombre de cellules plaquées est essentiel à la survie. Nous recommandons un million de cellules par plat de 35 millimètres.Le placage dans le milieu sérique-libre améliorera également considérablement l’attachement cellulaire. Les cellules obtenues avec cette méthode peuvent être traitées avec des cytokines ou des facteurs de croissance pour étudier les réponses différentielles chez les patients d’intérêt et de contrôles sains.

Research

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