Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

המחברים רוצים להודות ליבה של HIV קליני/הגידול Biore, הליבה למתן דגימות החולה והליבה מטבוליזם של הסלולר לאספקת זרימה cy, לנסות ניתוח. פרויקט זה מומן על ידי NIH P20GM121288 ו-P30GM114732.

כל השיטות המתוארות להלן אושרו על ידי מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת לואיזיאנה המרכז הרפואי של ניו אורלינס המועצה לסקירה מוסדית. כל הדם נאסף לאחר קבלת הסכמה מושכלת.
הערה: ההליך כולו מבוצע בתנאים סטריליים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות 2 (BSL2) כך שזהירות משמשת לטיפול בחומרים ביולו?...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג ממחיש את השימוש בתאים הראשוניים של הנושאים נגועים HIV כמודל לחקר מונוציטים מקרופאגים. HIV+ חולים שעברו עגלה לחיות עם זיהום במשך שנים מרובות יכול להיות גם שיתוף זיהומים אחרים הקשורים מערכת חיסונית פרוצים. כדי ללמוד האימונומודולזילציה בנוכחות של זיהום HIV כרונית, תאים נקצ...

נגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1) זיהום גורם לתפקוד המערכת החיסונית חמורה, אשר יכול להוביל לזיהומים אופורטוניסטים ולרכוש תסמונת הכשל החיסוני (איידס). למרות חולי איידס שעברו עגלה מאופיינים העומסים ויראלי נמוך CD4+ T תא ספירות, תפקוד של המערכת החיסונית ניתן להתפשר על אנשים אלה, המוביל לתגובה חיסונית לקוי כי כבר קשור לסיכון מוגבר לפתח סרטן1. המנגנונים של תפקוד המערכת החיסונית בחולים HIV על עגלת להישאר במידה רבה לא ידוע. לכן, אפיון תאים חיסוניים שמקורם בחולים וחקירת הביולוגיה והתפקוד שלהם הוא מרכיב קריטי של מחקר האיידס הנוכחי.
מונוציטים ו מקרופאגים הם הרגולטורים המפתח של תגובות החיסון ולשחק תפקידים בסיסיים בזיהום HIV2,3,4,5. הטרוגנית ופלסטיק בטבע, מקרופאגים ניתן לסווג באופן נרחב להפעלה קלאסי (M1) או מופעל לחילופין (M2). בעוד סיווג כללי זה הכרחי בעת הגדרת תנאים ניסיוניים, הסטטוס הפולריזציה של מקרופאגים ניתן להפוך על ידי מגוון של ציטוקינים6,7,8,9. למרות מספר מחקרים חקרו את ההשפעות של זיהום האיידס על התאים המונולוציטים והדנדריטים, פרטים מולקולריים של תגובות מונוציט מתווכת הם בעיקר לא ידוע6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. בין הגורמים המעורבים ברגולציה ותפקוד התא החיסונית, microRNAs (miRNAs), קצר שאינו קידוד RNAs שלאחר ההמרה לווסת ביטוי גנים, הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהקשר של מסלולים סלולריים עיקריים (כלומר, צמיחה, בידול, פיתוח, ו אפופטוזיס)20. מולקולות אלה תוארו כרגולטורים חשובים של שעתוק גורמים חיוניים להכתיב את הקיטוב הפונקציונלי של מקרופאגים21. התפקיד הפוטנציאלי של mirnas במונציטים מאנשים נגועים באיידס שעברו עגלה נחקר, אבל ההתקדמות בתחום דורש עבודה הרבה יותר22,23,24,25,26. נייר זה דן שיטה ממוטבת כדי transfect miRNAs ו siRNAs לתוך מונוציטים האנושי העיקרי של חולי איידס ופקדים.
פרוטוקול זה מסתמך על ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית, כמו המשכיות בהליך הטכני מסייע למנוע משתנים ניסיוניים מיותרים כאשר עובדים עם דגימות קליניות. עם זאת, השיטה מספקת טיפים חשובים (כלומר, מספר התאים מצופה או הדגירה קצר עם מדיה ללא סרום כדי לקדם את הדבקות של תאים לצלחת). בנוסף, התנאים הפולריזציה המשמשים בפרוטוקול זה נגזרים מהעבודה שפורסמה27,28,29.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) נותר חשש בריאותי גדול למרות המבוא של טיפול תרופתי משולב (עגלה) באמצע שנות ה-90. בעוד טיפול תרופתי ביעילות מורידה עומס נגיפי מערכתית ומשחזר רגיל CD4+ T ספירות תאים, זה לא מהווה מחדש מערכת חיסונית תפקודית לחלוטין. מערכת חיסונית לקוי באנשים שנדבקו ב-HIV שעברו עגלה עשוי להיות מאופיין על ידי הפעלה חיסונית, הזדקנות מוקדמת של תאים חיסוניים, או דלקת מתמשכת. תנאים אלה, יחד עם גורמי הצעת מחלה הקשורים לזיהום HIV, להוסיף מורכבות למחלה, אשר לא ניתן לשכפל בקלות במודלים סלולריים ובעלי חיים. כדי לחקור את האירועים המולקולריים בבסיס תפקוד המערכת החיסונית של חולים אלה, מערכת לתרבות ולתמרן מונוציטים הראשי האנושי בתוך מבחנה מוצג כאן. באופן ספציפי, הפרוטוקול מאפשר את התרבות ואת העיבוד של הראשי CD14+ מונוציטים שהתקבלו מאנשים נגועים ב-hiv שעברו עגלה, כמו גם מפקדים hiv-שלילי. השיטה כרוכה בבידוד, תרבות והעברה של מקרופאגים מונוציטים ובעלי בייט. בעוד קיטים הזמינים מסחרית וריאגנטים מועסקים, הפרוטוקול מספק עצות חשובות ותנאים ממוטבים לדבקות מוצלחת והעברה של מונוציטים עם מדבקות miRNA ו מעכבי כמו גם עם siRNAs.

באמצעות ההליך המתואר, מונוציטים האדם העיקרי מאנשים נגועים באיידס ותורמים בריאים היו מבודדים. כל הנתונים המוצגים כאן התקבלו מ-HIV+ נושאים שעברו עגלה עם נמוך (< 20 עותקים/mL) או העומסים ויראלי מגילוי ורגיל CD4+ T תאים ספירות. מיד לאחר בידוד, התאים היו מוכתמים, והזרימה cy,...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes at JoVE.com

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

מוצג כאן הוא פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד, culturing, העברה, וההבחנה העיקרי האנושי מונוציטים מאנשים נגועים בריאים ושליטה בריאה.

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

הידבקות ב- HIV גורמת לתפקוד לקוי של מערכת החיסון גם אצל אנשים העוברים טיפול תרופתי ללא וירוס ניתן לגילוי. שיטה זו מאפשרת ללמוד את תפקוד המונוציטים שהם הרגולטורים העיקריים של התגובה החיסונית. אנחנו אופטימיזציה טכניקה זו לבידוד, תרבות, ו transfection של מונוציטים ראשוניים אנושיים.אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את המנגנונים המולקולריים של תפקוד לקוי של מערכת החיסון אצל אנשים נגועים ב- HIV, אבל זה יכול להיות מיושם על כל מחקרים חיסוניים אחרים מעורבים מונוציטים. אם זו הפעם הראשונה שאתה עובד עם דם אנושי, זכור לעקוב אחר הפרוטוקולים biosafety הנכון ולהתייחס לכל הדגימות כחומר זיהומיות. לאחר איסוף 40 מיליליטר של דם אנושי שלם טרי בארבעה צינורות ואקום EDTA 10 מיליליטר, להשתמש בטכניקה סטרילית כדי להעביר את כל הדם לתוך צינור אחד 50 מיליליטר חרוט פרופילן ב ארון biosafety.בהתאם להוראות היצרן מערכת בידוד מונוציטים אנושית נבחרת, מוסיפים שני מיליליטר של קוקטייל בידוד מונוציטים מהערכה לצינור הדם והמערבולת של חרוזים מגנטיים מההערכה למשך 30 שניות. מוסיפים שני מיליליטר של חרוזים לדם ולהשתמש פיפטה סרולוגית 25 מיליליטר בזהירות לערבב את חרוזים עם הדם. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לפצל את הדם באופן שווה בין ארבעה צינורות 50 מיליליטר ולהוסיף 30 מיליליטר של PBS סטרילי בתוספת EDTA מילימולר אחד לכל צינור.מערבבים שוב עם פיפטה סרולוגית פלסטיק 25 מיליליטר וממקמים את הצינורות במחזיקים מגנטיים. לאחר 10 דקות, להשתמש פיפטה כדי לצייר את התוכן ממרכז כל צינור דואג לא לשאוב יותר ממיליליטר אחד של תאי דם אדומים ולחלק את תכולת הצינור לאחד מארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים נוספים של חרוזי המערבולת המגנטיים לכל צינור ומערבבים בעדינות את ת פתרון התא.מניחים את הצינורות בחזרה לתוך המחזיקים המגנטיים במשך חמש דקות לפני בזהירות העברת התוכן ממרכז כל צינור לאחד מארבעה צינורות חדשים 50 מיליליטר. כאשר כל המתלים התא הועברו, למקם כל צינור חדש 50 מיליליטר לתוך מחזיקי המגנט במשך חמש דקות לפני בזהירות העברת תוכן הצינור לתוך קבוצה שלישית של ארבעה צינורות 50 מיליליטר חדשים. ואז לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את כל ארבעת כדורי התא בסך הכל 10 מיליליטר של PBS סטרילי לספירה.לאחר הספירה, יש להשתמש מחדש במונוציטים המבודדים במהירות של פי 10 עד התאים השישיים למיליליטר של 37 מעלות צלזיוס ללא סרום RPMI 1640 בינוני בתוספת אנטיביוטיקה וצלחת מיליליטר אחד של תאים מתווסלים לתוך 35 מילימטר צלחות בארון ביו-בטיחות. לאחר מכן מניחים את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך 30 עד 60 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק בתחתית הבאר. כדי ליצור פריים עבור מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M1, הוסף 100 מיקרוליטרים של סרום חזיר עוברי המכיל 25 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לכל צלחת.כדי ליצור פריים עבור מקרופאגים עם פנוטיפ דמוי M2, הוסף 100 מיקרוליטרים של חזיר עוברי המכילים 50 ננוגרם למיליליטר של M-CSF לכל צלחת. עבור transfection מונוציטים עם חיקויים microRNA, מעכבים, או RNA מפריע קטן, בעקבות פרוטוקול היצרן עבור ערכת transfection, לדלל את RNAs שנבחרו במאגר לריכוז סופי של 1.83 micromolar ב 10 microliters של חיקוי מדולל או מעכב לכל transfection של פעם אחת 10 לנפח התאים החמישי. כדי להכין את reagent transfection, להוסיף מיקרוליטר אחד של פולימר שסופק צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ומיד להוסיף 90 microliters של המאגר המסופק על ידי ערכה כדי לקבל סך של 91 microliters של reagent לכל חילוף.Vortex עוצר במשך שלוש עד חמש שניות ו pipette 90 microliters של פתרון transfection לתוך הצינור המכיל 10 microliters של RNA מדולל. לאחר ערבוב עדין, דגירה הפתרון במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר לפני הוספת 100 microliters של קומפלקס transfection ל באר אחת של תאים. לאחר ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס, להחליף את המדיום עם שלושה מיליליטר של מדיום שלם המכיל את גורם הגדילה המתאים.ביום השישי לתרבות, החלף את על-טבעי התרבות מתרבות M1 בשלושה מיליליטר של מדיום בתוספת סרום חזיר עוברי, אנטיביוטיקה, ליפופולסכריד ואינטרפרון גמא והחלף את העל-טבעיים מתרבויות M2 בסרום חזיר עוברי, אנטיביוטיקה, M-CSF ואינטרלוקין-4. לאחר 24 שעות של תרבות, לשטוף כל צלחת של מקרופאגים פעילים פעמיים עם PBS טרי לכל לשטוף. עבור ניתוחי RNA וחלבון, lyse התאים המצורפים ישירות הצלחות כדי לאפשר איסוף של תוכן התא ששוחרר לניתוח שלהם.לניתוח ציטומטרי זרימה, לנתק את התאים עם שני מילימולרים EDTA ב PBS במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני בעדינות מגרד את התאים מתחתיות הלוח כדי לאפשר את האוסף שלהם לתוך 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר לניתוח שלהם. כאן היסטוגרמות מייצגות של תאים המופעלים על-ידי M1 ותאים שמקורם במטופלים עם רמות גבוהות יותר של תאים המופעלים על-ידי CD80 ו- CD83 ו- M2 עם רמות גבוהות יותר של CD163 ו- CD209 בהשוואה לתאי T0 שאינם מופעלים מוצגים. מעניין, CD80 ו CD83 נראה יותר לידי ביטוי בתאים שמקורם בשליטה בהשוואה לתאים שמקורם ב- HIV.ההשתנות של מונוציטים שנאספו טריים עם microRNA מקושקשות כמעט אינפרא אדום שכותרתו יותר מ 90% יעילות של transfection כפי שנקבע על ידי ציטומטריית זרימה מיקרוסקופיה confocal. בנוסף, transfection אינו מפחית באופן משמעותי את הכדאיות של תאים שמקורם בחולה או שליטה ללא קשר לשלב של התבגרות התא או תנאי transfection. Transfection תוצאות רגולציה יעילה של גן היעד על transfection עם RNA מפריע קטן ספציפי בשני היום הראשון והיום ארבעה לאחר הבידוד.יתר על כן, תאים מומרים עם חיקוי microRNA להדגים עלייה של פי 48 עד 72 בביטוי microRNA על תאים לא פתורים בעוד כל פקדי transfection להראות אין שינויים ניכרים. מספר התאים המ מצופים הוא קריטי להישרדות. אנו ממליצים על מיליון תאים לכל צלחת 35 מילימטר.ציפוי במדיום ללא סרום ישפר מאוד גם את ההחזקה של התא. תאים המתקבלים בשיטה זו יכולים להיות מטופלים עם ציטוקיני או גורמי גדילה כדי ללמוד תגובות דיפרנציאליות בחולים בעלי עניין ובקרות בריאות.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

הדור של תרבויות רפסודות Organotypic של קרטינוציטים אדם מן המעלה הראשונה

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...