Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare il nucleo del biorepository clinico/tumorale dell'HIV per aver fornito campioni di pazienti e il nucleo del metabolismo dell'immunologia cellulare per la fornitura dell'analisi della citometria del flusso. Questo progetto è stato finanziato da NIH P20GM121288 e P30GM114732.

Tutti i metodi descritti di seguito sono stati approvati dal Louisiana State University Health Sciences Center New Orleans Institutional Review Board. Tutto il sangue è stato raccolto dopo aver ottenuto il consenso informato.
NOTA: L'intera procedura viene eseguita in condizioni sterili in un impianto di biosicurezza di livello 2 (BSL2) in modo che venga utilizzata cautela per la gestione di materiali biologici. In particolare, ogni passo viene eseguita utilizzando tecniche sterili sotto un a...

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	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

Il protocollo presentato dimostra l'uso di cellule primarie di soggetti infettati da HIV come modello per studiare monociti e macrofagi. HIV- I pazienti sottoposti a cART vivono con infezione per più anni e possono anche avere altre co-infezioni correlate a un sistema immunitario compromesso. Per studiare l'immunomodulazione in presenza di infezione cronica da HIV, le cellule sono state raccolte direttamente dai pazienti. Poiché i miRNA hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nello sviluppo cellular...

L'infezione da virus immunodeficienza umana-1 (HIV-1) causa una grave disfunzione immunitaria, che può portare a infezioni opportunistiche e sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Anche se i pazienti affetti da HIV sottoposti a cART sono caratterizzati da bassi carichi virali e normali conteggi di cellule CD4- T, il funzionamento del sistema immunitario può essere compromesso in questi individui, portando ad una risposta immunitaria disfunzionale che è stata collegata ad un aumento del rischio di sviluppare il cancro1. I meccanismi della disfunzione immunitaria nei pazienti affetti da HIV su cART rimangono in gran parte sconosciuti. Pertanto, caratterizzare le cellule immunitarie derivate dal paziente e studiare la loro biologia e funzione è una componente fondamentale dell'attuale ricerca sull'HIV.
Monociti e macrofagi sono regolatori chiave delle risposte immunitarie e svolgono un ruolo fondamentale nell'infezione da HIV2,3,4,5. Eterogenei e di natura plastica, i macrofagi possono essere ampiamente classificati in attivazione classica (M1) o in alternativa attivati (M2). Mentre questa classificazione generale è necessaria quando si impostano condizioni sperimentali, lo stato di polarizzazione dei macrofagi può essere invertito da una varietà di citochine6,7,8,9. Anche se diversi studi hanno studiato gli effetti dell'infezione da HIV su monociti e cellule dendritiche, i dettagli molecolari delle risposte mediate da monociti sono in gran parte sconosciuti6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Tra i fattori coinvolti nella regolazione e nella funzione delle cellule immunitarie, i microRNA (miRNA), i brevi RNA non codificanti che regolano post-trascrizione l'espressione genica, hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nel contesto delle principali vie cellulari (cioè, crescita, differenziazione, sviluppo e apoptosi)20. Queste molecole sono state descritte come importanti regolatori di fattori di trascrizione essenziali per dettare la polarizzazione funzionale dei macrofagi21. È stato studiato il ruolo potenziale dei miRNA nei monociti di individui affetti da HIV sottoposti a cART, ma i progressi nel campo richiedono molto più lavoro22,23,24,25,26. Questo documento illustra un metodo ottimizzato per trasfect miRNA e siRNA in monociti umani primari da pazienti e controlli infettati da HIV.
Questo protocollo si basa su reagenti e kit disponibili in commercio, poiché la continuità nella procedura tecnica consente di eliminare le variabili sperimentali non necessarie quando si lavora con campioni clinici. Ciò nonostante, il metodo fornisce suggerimenti importanti (cioè il numero di cellule placcate o una breve incubazione con supporti senza siero per promuovere l'aderenza delle cellule alla piastra). Inoltre, le condizioni di polarizzazione utilizzate in questo protocollo derivano dal lavoro pubblicato27,28,29.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

Il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) rimane una delle principali preoccupazioni per la salute, nonostante l'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) a metà degli anni '90. Mentre la terapia antiretrovirale abbassa in modo efficiente il carico virale sistemico e ripristina il normale CD4- conteggi di cellule T, non ricostituisce un sistema immunitario completamente funzionale. Un sistema immunitario disfunzionale in individui infettati da HIV sottoposti a cART può essere caratterizzato da attivazione immunitaria, invecchiamento precoce delle cellule immunitarie o infiammazione persistente. Queste condizioni, insieme ai fattori comorbidi associati all'infezione da HIV, aggiungono complessità alla malattia, che non può essere facilmente riprodotta nei modelli cellulari e animali. Per studiare gli eventi molecolari alla base della disfunzione immunitaria in questi pazienti, viene presentato un sistema per la coltura e la manipolazione dei monociti primari umani in vitro. In particolare, il protocollo consente la coltura e la trasfezione del CD14 primario- monociti ottenuti da individui affetti da HIV sottoposti a cART e da controlli HIV-negativi. Il metodo prevede l'isolamento, la cultura e la trasfezione di monociti e macrofagi derivati da monociti. Mentre sono impiegati kit e reagenti disponibili in commercio, il protocollo fornisce importanti suggerimenti e condizioni ottimizzate per il successo dell'aderenza e della trasfezione dei monociti con mimimi e inibitori di miRNA, nonché con i siRNA.

Utilizzando la procedura descritta, sono stati isolati i monociti umani primari di individui affetti da HIV e donatori sani. Tutti i dati qui presentati sono stati ottenuti daHIV: soggetti sottoposti a cART con basso (<20 copie/mL) o carichi virali non rilevabili e normali conteggi di cellule CD4e T. Subito dopo l'isolamento, le cellule sono state macchiate, e la citometria di flusso è stata eseguita per confermare la purezza delle popolazioni di cellule. I risultat...

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Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

L'infezione da HIV causa disfunzione immunitaria anche in individui sottoposti a terapia antiretrovirale senza virus rilevabile. Questo metodo consente lo studio della funzione dei monociti che sono regolatori chiave della risposta immunitaria. Abbiamo ottimizzato questa tecnica per l'isolamento, la cultura e la trasfezione dei monociti primari umani.Usiamo questo metodo per comprendere i meccanismi molecolari della disfunzione immunitaria negli individui infetti da HIV, ma può essere applicato a qualsiasi altro studio immunitario che coinvolga i monociti. Se è la prima volta che lavori con il sangue umano, ricorda di seguire i protocolli di biosicurezza appropriati e di trattare tutti i campioni come materiale possibilmente infettivo. Dopo aver raccolto 40 millilitri di sangue intero umano fresco in quattro tubi a vuoto EDTA da 10 millilitri, utilizzare una tecnica sterile per trasferire tutto il sangue in un singolo tubo di propilene conico da 50 millilitri in un armadio di biosicurezza.Seguendo le istruzioni del produttore da un kit di isolamento monocito umano selezionato, aggiungere due millilitri di cocktail di isolamento monocita dal kit al tubo di sangue e vortice le perline magnetiche dal kit per 30 secondi. Aggiungere due millilitri di perline al sangue e utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per mescolare accuratamente le perline con il sangue. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, dividere il sangue equamente tra quattro tubi da 50 millilitri e aggiungere 30 millilitri di PBS sterile integrati con un EDTA millimolare ad ogni tubo.Mescolare nuovamente con una pipetta sierologica in plastica da 25 millilitri e posizionare i tubi in supporti magnetici. Dopo 10 minuti, utilizzare una pipetta per disegnare il contenuto dal centro di ogni tubo facendo attenzione a non aspirare più di un millilitro di globuli rossi e distribuire il contenuto del tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Aggiungere altri 500 microlitri delle perline magnetiche vorticose a ciascun tubo e mescolare delicatamente la soluzione cellulare.Riposizionare i tubi nei supporti magnetici per cinque minuti prima di trasferire attentamente il contenuto dal centro di ciascun tubo in uno dei quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Una volta trasferite tutte le sospensioni cellulari, posizionare ogni nuovo tubo da 50 millilitri nei supporti del magnete per cinque minuti prima di trasferire attentamente il contenuto del tubo in un terzo set di quattro nuovi tubi da 50 millilitri. Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e rimosogliere tutti e quattro i pellet cellulari in un totale di 10 millilitri di PBS sterile per il conteggio.Dopo il conteggio, rimescolare i monociti isolati a una volta 10 alla sesta cellule per millilitro di 37 gradi Celsius mezzo RPMI 1640 privo di siero integrato con antibiotici e placcare un millilitro di cellule rimescolate in piastre di 35 millimetri in un armadio di biosicurezza. Quindi posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 30-60 minuti per consentire alle cellule di aderire ai fondi del pozzo. Per prime per i macrofagi con un fenotipo simile a M1, aggiungere 100 microlitri di siero bovino fetale contenenti 25 nanogrammi per millilitro di GM-CSF a ciascuna piastra.Per innescare macrofagi con un fenotipo simile a M2, aggiungere 100 microlitri di bovini fetali contenenti 50 nanogrammi per millilitro di M-CSF a ciascuna piastra. Per la trasfezione di monociti con imitazioni di microRNA, inibitori o un piccolo RNA interferente, seguendo il protocollo del produttore per il kit di trasfezione, diluire gli RNA selezionati nel buffer a una concentrazione finale di 1,83 micromolare in 10 microlitri di imitazione diluita o inibitore per trasfezione di una per 10 alla quinta quantità di cellule. Per preparare il reagente di trasfezione, aggiungere un microliter del polimero fornito a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere immediatamente 90 microlitri del tampone fornito dal kit per ottenere un totale di 91 microlitri di reagente per trasfezione.Vortice il reggente per tre o cinque secondi e pipetta 90 microlitri della soluzione di trasfezione nel tubo contenente 10 microlitri di RNA diluito. Dopo una miscelazione delicata, incubare la soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere 100 microlitri di complesso di trasfezione a un pozzo di cellule. Dopo quattro ore a 37 gradi Celsius, sostituire il mezzo con tre millilitri di mezzo completo contenente il fattore di crescita appropriato.Il sesto giorno di coltura, sostituire i supernatanti di coltura delle colture M1 con tre millilitri di mezzo integrati con siero bovino fetale, antibiotici, lipopolysaccaride e gamma di interferone e sostituire i supernatanti delle colture M2 con mezzo integrato con siero bovino fetale, antibiotici, M-CSF e interleuchina-4. Dopo 24 ore di coltura, lavare ogni piatto di macrofagi attivati due volte con PBS fresco per lavaggio. Per le analisi dell'RNA e delle proteine, lesinare le cellule attaccate direttamente nelle piastre per consentire la raccolta del contenuto cellulare rilasciato per la loro analisi.Per l'analisi citometrica del flusso, staccare le cellule con due EDTA millimolare in PBS per 10 minuti a 37 gradi Celsius prima di raschiare delicatamente le cellule dai fondi della piastra per consentire la loro raccolta in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri per la loro analisi. Qui vengono mostrati istogrammi rappresentativi di cellule di controllo attivate da M1 e derivate dal paziente con livelli aumentati di cellule attivate da CD80 e CD83 e M2 con livelli aumentati di CD163 e CD209 rispetto alle cellule T0 non attivate. È interessante notare che CD80 e CD83 sembravano essere più espressi nelle cellule derivate dal controllo rispetto alle cellule derivate dall'HIV.La trasfezione di monociti appena raccolti con un microRNA criptato al vicino infrarosso si traduce in un'efficienza di trasfezione superiore al 90% determinata dalla citometria a flusso e dalla microscopia confocale. Inoltre, la trasfezione non riduce significativamente la vitalità delle cellule derivate dal paziente o di controllo indipendentemente dallo stadio di maturazione cellulare o dalle condizioni di trasfezione. La trasfezione si traduce in un'efficace downregolazione del gene bersaglio durante la trasfezione con il piccolo RNA interferente specifico sia al primo giorno che al quarto giorno dopo l'isolamento.Inoltre, le cellule trasfette con imitazione del microRNA dimostrano un aumento da 48 a 72 volte dell'espressione del microRNA rispetto alle cellule non trasfette, mentre tutti i controlli di trasfezione non mostrano cambiamenti apprezzabili. Il numero di cellule placcate è fondamentale per la sopravvivenza. Consigliamo un milione di cellule per piatto da 35 millimetri.La placcatura in mezzo privo di siero migliorerà notevolmente anche l'attacco cellulare. Le cellule ottenute con questo metodo possono essere trattate con citochine o fattori di crescita per studiare risposte differenziali in pazienti di interesse e controlli sani.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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