Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
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著者らは、患者サンプルを提供するためのHIV臨床/腫瘍バイオレポジトリコアと、フローサイトメトリー分析を提供するための細胞免疫学代謝コアに感謝したいと考えています。このプロジェクトは、NIH P20GM121288とP30GM114732によって資金提供されました。

以下に説明するすべての方法は、ルイジアナ州立大学健康科学センターニューオーリンズ機関審査委員会によって承認されています.インフォームド・コンセントを得た後、すべての血液を採取した。
注:全手順は、生物学的材料の処理に注意が必要になるように、バイオセーフティレベル2(BSL2)施設の滅菌条件下で行われます。特に、各工程は、バイオセーフティキャビ?...

<ol>
	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

提示されたプロトコルは、単球およびマクロファージを研究するためのモデルとしてHIV感染被験者からの一次細胞の使用を示す。HIV+cARTを受けている患者は、何年も感染症と共に生きており、また、侵害された免疫系に関連する他の共感染を持つことができます。HIV慢性感染の存在下で免疫調節を研究するために、細胞を患者から直接採取した。miRNAが細胞の発達と分化に大きな役割?...

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)感染は重度の免疫機能障害を引き起こし、日和見感染や後天性免疫不全症候群(AIDS)を引き起こす可能性がある。cARTを受けているHIV感染患者は、ウイルス負荷が低く、正常なCD4+T細胞数を特徴とするが、免疫系の機能はこれらの個体において損なわれ得るが、癌を発症するリスクの増加に関連する機能不全免疫応答につながる。cART上のHIV患者における免疫機能障害のメカニズムはほとんど未知のままである。したがって、患者由来の免疫細胞を特徴付け、その生物学と機能を調べるのは、現在のHIV研究の重要な要素です。
単球およびマクロファージは免疫応答の主要な調節剤であり、HIV感染において基本的な役割を果たす2,3,4,5.本質的に異種およびプラスチックは、マクロファージを広く古典的に活性化(M1)または代替活性化(M2)に分類することができる。この一般的な分類は実験条件を設定する際に必要であるが、マクロファージの偏光状態は、種々のサイトカイン6、7、8、9によって逆転してもよい。いくつかの研究は、単球および樹状細胞に対するHIV感染の影響を調査しているが、単球媒介応答の分子詳細はほとんど不明である6,7,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.免疫細胞の調節および機能に関与する因子の中で、microRNA(miRNA)は、遺伝子発現後に転写的に調節する短い非コードRNA、主要な細胞経路(すなわち、増殖、分化、発達、およびアポトーシス)20の文脈において重要な役割を果たすることが示されている。これらの分子は、マクロファージ21の機能的分極化を指示するために不可欠な転写因子の重要な調節因子として記載されている。cARTを受けているHIV感染者からの単球におけるmiRNAの潜在的な役割が調査されているが、現場での進歩は、はるかに多くの作業を必要とする22、23、24、25、26。本論文では、HIVに感染した患者と対照からmiRNAとsiRNAを原発性ヒト単球にトランスフェクトする最適化された方法について論じる。
このプロトコルは、技術的な手順の連続性は臨床サンプルを扱うときに不要な実験変数を排除するのに役立つため、市販の試薬およびキットに依存しています。それにもかかわらず、この方法は、重要なヒント(すなわち、プレートへの細胞の付着を促進するために無血清媒体を用いためっきまたは短時間のインキュベーションの細胞数)を提供する。さらに、このプロトコルで使用される偏光条件は、公開された作品27、28、29に由来する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

ヒト免疫不全ウイルス(HIV)は、1990年代半ばに併用抗レトロウイルス療法(cART)が導入されたにもかかわらず、依然として大きな健康上の懸念事項である。抗レトロウイルス療法は、効率的に全身性ウイルス負荷を低下させ、正常なCD4+T細胞数を復元するが、それは完全に機能的な免疫系を再構成しない。cARTを受けているHIV感染者の機能不全免疫系は、免疫活性化、免疫細胞の早期老化、または持続的な炎症によって特徴付けられる。これらの状態は、HIV感染に関連する併発因子と共に、細胞および動物モデルでは容易に再現できない疾患に複雑さを加える。これらの患者における免疫機能障害の根底にある分子事象を調べるために、インビトロでヒト一次単球を培養および操作するシステムをここに提示する。具体的には、このプロトコルは、cARTを受けているHIV感染個体から得られる一次CD14+単球の培養およびトランスフェクション、ならびにHIV陰性対照から可能である。この方法は、単球および単球由来マクロファージの単離、培養、およびトランスフェクションを含む。市販のキットと試薬が採用されている間、このプロトコルは、miRNA模倣および阻害剤およびsiRNAを用いた単球の付着およびトランスフェクションを成功させるための重要なヒントと最適化された条件を提供する。

記載された手順を用いて、HIV感染者および健康なドナーからの原発性ヒト単球を単離した。ここで提示されたすべてのデータは、低い(<20コピー/mL)または検出不能なウイルス負荷と通常のCD4+T細胞数を有するcARTを受けているHIV+被験者から得られた。単離直後に細胞を染色し、フローサイトメトリーを行い、細胞集団の純度を確認した。結果は、>97%の?...

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Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

ここでは、HIVに感染した個体および健全なコントロールからヒト一次単球を分離、培養、トランスフェクション、および区別するための最適化されたプロトコルです。

原発性ヒト単球の単離、トランスフェクション、培養

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV感染は、検出可能なウイルスのない抗レトロウイルス療法を受けている個人でも免疫機能障害を引き起こす。この方法は、免疫応答の主要な調節因子である単球機能の研究を可能にする。我々は、ヒトの一次単球の単球の単離、培養、トランスフェクションのためにこの技術を最適化しました。この方法を用い、HIV感染者の免疫機能障害の分子機構を理解しますが、単球を含む他の免疫研究にも応用できます。これが人間の血液を扱う初めての場合は、適切な生体安全プロトコルに従い、すべてのサンプルを感染性物質として扱うことを忘れないでください。4つの10ミリリットルEDTA真空管で40ミリリットルの新鮮なヒト全血を採取した後、無菌技術を使用して、バイオセーフティキャビネット内の単一の50ミリリットルの円錐形プロピレンチューブに血液のすべてを移動させます。選択したヒト単球分離キットからの製造業者の指示に従って、キットから血液のチューブに2ミリリットルの単球分離カクテルを加え、キットから磁気ビーズを30秒間渦に入れます。血液にビーズを2ミリリットル加え、25ミリリットルの血清ピペットを使用してビーズと血液を慎重に混合します。室温で5分後、4つの50ミリリットルチューブの間で血液を均等に分割し、各チューブに1ミリモルEDTAを加えた30ミリリットルの無菌PBSを加える。プラスチック25ミリリットル血清ピペットと再び混合し、磁気ホルダーにチューブを置きます。10分後、ピペットを使用して各チューブの中央から内容物を引き出し、1ミリリットル以上の赤血球を吸引せず、チューブの内容物を4つの新しい50ミリリットルチューブの1つに分配します。各チューブに500マイクロリットルのボルテックス磁気ビーズを加え、細胞溶液を穏やかに混合します。各チューブの中央から新しい50ミリリットルチューブの1つに慎重に内容物を移す前に、チューブを5分間磁気ホルダーに戻します。すべての細胞懸濁液が移された場合、新しい50ミリリットルチューブを磁石ホルダーに5分間入れ、チューブの内容物を新しい50ミリリットルチューブ4個の第3セットに慎重に移します。次いで遠心分離によって細胞を収集し、計数用無菌PBSの合計10ミリリットルで4つの細胞ペレットすべてを再懸濁します。カウント後、分離した単球を1回10〜37°Cの無血清RPMI 1640培地のミリリットル当たり1回10倍に再懸濁し、再懸濁細胞の1ミリリットルをバイオセーフティキャビネットの35ミリメートルプレートにプレートします。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを30〜60分間置き、細胞がウェルボトムに付着できるようにします。M1様表現型のマクロファージのプライムには、各プレートにGM-CSFの1ミリリットル当たり25ナノグラムを含む100マイクロリットルの胎児ウシ血清を加えます。M2様表現型のマクロファージのプライムには、M-CSFの1ミリリットル当たり50ナノグラムを含む100マイクロリットルの胎児ウシを各プレートに加えます。マイクロRNA模倣、阻害剤、または小さな干渉RNAによる単球トランスフェクションの場合、トランスフェクションキットの製造業者のプロトコルに従い、選択したRNAを10マイクロリットルの希釈模倣または阻害剤の10マイクロリットルで最終濃度1.83マイクロモルに希釈し、5番目の細胞体積に10倍の細胞体積を与えます。トランスフェクション試薬を調製するには、提供されたポリマーの1マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加え、キット提供バッファーの90マイクロリットルを直ちに添加して、トランスフェクションごとに合計91マイクロリットルの試薬を得る。摂液を3〜5秒間ボルテックスし、10マイクロリットルの希釈RNAを含むチューブにトランスフェクション溶液のピペット90マイクロリットルを送り込む。穏やかな混合の後、細胞の1つのウェルにトランスフェクション複合体の100マイクロリットルを加える前に室温で15分間溶液をインキュベートする。摂氏37度で4時間後、適切な成長因子を含む完全な培地の3ミリリットルで培地を交換する。培養の6日目に、M1培養物の培養上清を胎児ウシ血清、抗生物質、リポ多糖類、インターフェロンガンマを添加した3ミリリットルの培地に置き換え、M2培養物の上清をウシ血清、抗生物質、M-CSF、インターロイキン4を補った培地に置き換える。24時間培養した後、活性マクロファージの各プレートを洗浄ごとに新鮮なPBSで2回洗浄する。RNAおよびタンパク質解析では、取り付けた細胞をプレートに直接解凍して、放出された細胞内容物を分析のために収集できるようにします。フローサイトメトリック解析では、PBSで2ミリモルEDTAの細胞を37°Cで10分間取り外してから、プレート底部から細胞をそっと削り取り、分析のために1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに回収できるようにします。ここでは、非活性化T0細胞と比較してCD163およびCD209の増加レベルを有する、CD80およびCD83およびM2活性化細胞の増加したM1活性化対照および患者由来細胞の代表的なヒストグラムが示されている。興味深いことに、CD80およびCD83は、HIV由来細胞と比較して、コントロール由来細胞でより高く発現しているように見えた。スクランブル近赤外標識マイクロRNAを用いて採取したばかりのモノサイトのトランスフェクションは、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡で決定されたトランスフェクションの効率が90%を超える結果となります。さらに、トランスフェクションは、細胞成熟の段階またはトランスフェクション条件に関係なく、患者由来または対照細胞の生存率を有意に低下させるものではない。トランスフェクションは、1日目と4日目の分離の両方で特異的な小さな干渉RNAを使用してトランスフェクション時に標的遺伝子の効果的なダウンレギュレーションを生み出します。さらに、マイクロRNAを模倣してトランスフェクトされた細胞は、トランスフェクションされていない細胞に対するマイクロRNA発現の48〜72倍の増加を示す一方で、トランスフェクションコントロールの全ては顕著な変化を示さない。メッキされた細胞の数は生存に不可欠です。35ミリメートル皿あたり100万個の細胞をお勧めします。無血清培地でのめっきも細胞の付着性を大きく向上させます。この方法で得られた細胞は、サイトカインまたは成長因子を用いて、関心のある患者および健康なコントロールの患者における差動応答を研究することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

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移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

初代ヒトケラチノサイトからカドヘリン文化の生成

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

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プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

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ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

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Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

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As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

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表現型分析のためのヒト皮膚からリンパ球単離と<em&gt; ex vivoで</em&gt;細胞培養

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...