Name: isolation, transfection, and culture of primary human monocytes
Uploaded: 2019-12-16T13:00:00
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저자는 유세포 분석 분석을 제공하기 위한 환자 샘플 및 세포 면역학 물질 대사 코어를 제공하는 HIV 임상/종양 Biorepository Core에 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH P20GM121288 및 P30GM114732에 의해 투자되었습니다.

아래에 설명 된 모든 방법은 루이지애나 주립 대학 건강 과학 센터 뉴 올리언스 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 혈액은 통보된 동의를 얻은 후에 수집되었습니다.
참고: 전체 절차는 생물 안전 수준 2(BSL2) 시설에서 멸균 조건하에서 수행되므로 생물학적 물질을 처리하는 데 주의가 사용됩니다. 특히, 각 단계는 생물 안전 성 캐비닛 에서 멸균 기술을 사용하여 ?...

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	<li>Slim, J., Saling, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Management+of+Inflammation+in+the+HIV+Population.">A Review of Management of Inflammation in the HIV Population.</a> Biomedical Research International. 2016, 3420638 (2016).</li><li>Herskovitz, J., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+the+Macrophage:+From+Cell+Reservoirs+to+Drug+Delivery+to+Viral+Eradication.">HIV and the Macrophage: From Cell Reservoirs to Drug Delivery to Viral Eradication.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 52-67 (2019).</li><li>Machado Andrade, V., Stevenson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+and+Viral+Factors+Influencing+Interplay+between+the+Macrophage+and+HIV-1.">Host and Viral Factors Influencing Interplay between the Macrophage and HIV-1.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 33-43 (2019).</li><li>Merino, K. M., Allers, C., Didier, E. S., Kuroda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Monocyte/Macrophages+during+HIV/SIV+Infection+in+Adult+and+Pediatric+Acquired+Immune+Deficiency+Syndrome.">Role of Monocyte/Macrophages during HIV/SIV Infection in Adult and Pediatric Acquired Immune Deficiency Syndrome.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1693 (2017).</li><li>Wacleche, V. S., Tremblay, C. L., Routy, J. P., Ancuta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Monocytes+and+Dendritic+Cells:+Contribution+to+HIV+Pathogenesis.">The Biology of Monocytes and Dendritic Cells: Contribution to HIV Pathogenesis.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li><li>Davis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+M1/M2+polarization+dynamically+adapts+to+changes+in+cytokine+microenvironments+in+Cryptococcus+neoformans+infection.">Macrophage M1/M2 polarization dynamically adapts to changes in cytokine microenvironments in Cryptococcus neoformans infection.</a> MBio. 4 (3), e00264 (2013).</li><li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Human+Macrophage+M1-M2+Polarization+Balance+by+Hypoxia+and+the+Triggering+Receptor+Expressed+on+Myeloid+Cells-1.">Regulation of Human Macrophage M1-M2 Polarization Balance by Hypoxia and the Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1097 (2017).</li><li>Van Overmeire, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+and+GM-CSF+Receptor+Signaling+Differentially+Regulate+Monocyte+Maturation+and+Macrophage+Polarization+in+the+Tumor+Microenvironment.">M-CSF and GM-CSF Receptor Signaling Differentially Regulate Monocyte Maturation and Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 76 (1), 35-42 (2016).</li><li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+macrophage+polarization+in+vitro:+maturation+and+activation+methods+compared.">Human macrophage polarization in vitro: maturation and activation methods compared.</a> Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).</li><li>Almeida, M., Cordero, M., Almeida, J., Orfao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+subsets+of+peripheral+blood+dendritic+cells+show+distinct+phenotypic+and+functional+abnormalities+in+HIV-1+infection.">Different subsets of peripheral blood dendritic cells show distinct phenotypic and functional abnormalities in HIV-1 infection.</a> AIDS. 19 (3), 261-271 (2005).</li><li>Ciesek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+TRAIL-dependent+cytotoxicity+of+CD1c-positive+dendritic+cells+in+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Impaired TRAIL-dependent cytotoxicity of CD1c-positive dendritic cells in chronic hepatitis C virus infection.</a> Journal of Viral Hepatitis. 15 (3), 200-211 (2008).</li><li>Granelli-Piperno, A., Golebiowska, A., Trumpfheller, C., Siegal, F. P., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1-infected+monocyte-derived+dendritic+cells+do+not+undergo+maturation+but+can+elicit+IL-10+production+and+T+cell+regulation.">HIV-1-infected monocyte-derived dendritic cells do not undergo maturation but can elicit IL-10 production and T cell regulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7669-7674 (2004).</li><li>Hearps, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+infection+induces+age-related+changes+to+monocytes+and+innate+immune+activation+in+young+men+that+persist+despite+combination+antiretroviral+therapy.">HIV infection induces age-related changes to monocytes and innate immune activation in young men that persist despite combination antiretroviral therapy.</a> AIDS. 26 (7), 843-853 (2012).</li><li>Heggelund, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+toll-like+receptor+2+in+mononuclear+cells+from+HIV-infected+patients+induces+chemokine+responses:+possible+pathogenic+consequences.">Stimulation of toll-like receptor 2 in mononuclear cells from HIV-infected patients induces chemokine responses: possible pathogenic consequences.</a> Clinical and Experimental Immunology. 138 (1), 116-121 (2004).</li><li>Hernandez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+TLR2+and+TLR4+in+dendritic+cells+in+response+to+HIV+type+1+and+coinfection+with+opportunistic+pathogens.">Up-regulation of TLR2 and TLR4 in dendritic cells in response to HIV type 1 and coinfection with opportunistic pathogens.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 27 (10), 1099-1109 (2011).</li><li>Hernandez, J. C., Latz, E., Urcuqui-Inchima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induces+the+first+signal+to+activate+the+NLRP3+inflammasome+in+monocyte-derived+macrophages.">HIV-1 induces the first signal to activate the NLRP3 inflammasome in monocyte-derived macrophages.</a> Intervirology. 57 (1), 36-42 (2014).</li><li>Low, H. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR8+regulation+of+LILRA3+in+monocytes+is+abrogated+in+human+immunodeficiency+virus+infection+and+correlates+to+CD4+counts+and+virus+loads.">TLR8 regulation of LILRA3 in monocytes is abrogated in human immunodeficiency virus infection and correlates to CD4 counts and virus loads.</a> Retrovirology. 13, 15 (2016).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Impairment+of+Myeloid+Dendritic+Cells+during+Advanced+Stage+of+HIV-1+Infection:+Role+of+Factors+Regulating+Cytokine+Signaling.">Functional Impairment of Myeloid Dendritic Cells during Advanced Stage of HIV-1 Infection: Role of Factors Regulating Cytokine Signaling.</a> PLoS ONE. 10 (10), e0140852 (2015).</li><li>Sachdeva, M., Sharma, A., Arora, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+negative+regulators+of+cytokine+signaling+during+chronic+HIV+disease+cause+functionally+exhausted+state+of+dendritic+cells.">Increased expression of negative regulators of cytokine signaling during chronic HIV disease cause functionally exhausted state of dendritic cells.</a> Cytokine. 91, 118-123 (2017).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Li, H., Jiang, T., Li, M. Q., Zheng, X. L., Zhao, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+of+Macrophages+Polarization+by+MicroRNAs.">Transcriptional Regulation of Macrophages Polarization by MicroRNAs.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1175 (2018).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Analyses+of+MicroRNA+Profiling+in+Interleukin-27+Treated+Monocyte-Derived+Human+Dendritic+Cells+Using+Deep+Sequencing:+A+Pilot+Study.">Genome-Wide Analyses of MicroRNA Profiling in Interleukin-27 Treated Monocyte-Derived Human Dendritic Cells Using Deep Sequencing: A Pilot Study.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (5), (2017).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+miR-126-5p+Enhances+the+Inflammatory+Responses+of+Monocytes+to+Lipopolysaccharide+Stimulation+by+Suppressing+Cylindromatosis+in+Chronic+HIV-1+Infection.">MicroRNA miR-126-5p Enhances the Inflammatory Responses of Monocytes to Lipopolysaccharide Stimulation by Suppressing Cylindromatosis in Chronic HIV-1 Infection.</a> Journal of Virology. 91 (10), (2017).</li><li>Lodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+MicroRNAs-221+and+-222+Inhibit+HIV-1+Entry+in+Macrophages+by+Targeting+the+CD4+Viral+Receptor.">Host MicroRNAs-221 and -222 Inhibit HIV-1 Entry in Macrophages by Targeting the CD4 Viral Receptor.</a> Cell Reports. 21 (1), 141-153 (2017).</li><li>Ma, L., Shen, C. J., Cohen, E. A., Xiong, S. D., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-1236+inhibits+HIV-1+infection+of+monocytes+by+repressing+translation+of+cellular+factor+VprBP.">miRNA-1236 inhibits HIV-1 infection of monocytes by repressing translation of cellular factor VprBP.</a> PLoS ONE. 9 (6), e99535 (2014).</li><li>Riess, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferons+Induce+Expression+of+SAMHD1+in+Monocytes+through+Down-regulation+of+miR-181a+and+miR-30a.">Interferons Induce Expression of SAMHD1 in Monocytes through Down-regulation of miR-181a and miR-30a.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 264-277 (2017).</li><li>Buchacher, T., Ohradanova-Repic, A., Stockinger, H., Fischer, M. B., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+Polarization+of+Human+Macrophages+Favors+Survival+of+the+Intracellular+Pathogen+Chlamydia+pneumoniae.">M2 Polarization of Human Macrophages Favors Survival of the Intracellular Pathogen Chlamydia pneumoniae.</a> PLoS ONE. 10 (11), e0143593 (2015).</li><li>Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+profiles+of+human+M-CSF-generated+macrophages+and+comparison+of+M1-markers+in+classically+activated+macrophages+from+GM-CSF+and+M-CSF+origin.">Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin.</a> Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).</li><li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models.">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li><li>Tarique, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic,+functional,+and+plasticity+features+of+classical+and+alternatively+activated+human+macrophages.">Phenotypic, functional, and plasticity features of classical and alternatively activated human macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 53 (5), 676-688 (2015).</li></ol>

제시된 프로토콜은 단핵구 및 대식세포를 공부하기 위한 모형으로 HIV 감염한 과목에서 1 차적인 세포의 사용을 보여줍니다. HIV+ cART를 겪고 있는 환자는 여러 해 동안 감염과 함께 살고 있으며 손상된 면역 체계와 관련된 다른 공동 감염을 가질 수도 있습니다. HIV 만성 감염의 존재에서 면역 조절을 연구하기 위해 세포는 환자로부터 직접 수확되었습니다. miRNA가 세포 발달 및 분화에 중요?...

인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1) 감염은 기회 감염 및 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)으로 이어질 수있는 심각한 면역 기능 장애를 유발합니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염 환자는 낮은 바이러스 하중 및 일반적인 CD4+ T 세포 수에 의해 특징지더라도, 면역 계통의 기능은 암 발전의 증가한 리스크에 연결되는 역기능 면역 반응으로 이끌어 내는 이 개별에서 손상될 수 있습니다1. cART에 HIV 환자에 있는 면역 기능 장애의 기계장치는 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 따라서 환자 유래 면역 세포를 특성화하고 생물학 및 기능을 조사하는 것이 현재 HIV 연구의 중요한 구성 요소입니다.
단핵구와 대식세포는 면역 반응의 주요 조절자이며 HIV 감염2,3,4,5에서근본적인 역할을 합니다. 본질적으로 이질성 및 플라스틱, 대식세포는 고전적으로 활성화(M1) 또는 대안적으로 활성화(M2)로 광범위하게 분류될 수 있다. 이러한 일반적인 분류는 실험 조건을 설정할 때 필요하지만, 대식세포의 편광 상태는다양한사이토카인6,7,8,9에의해 역전될 수 있다. 여러 연구가 단핵구와 수지상 세포에 대한 HIV 감염의 영향을 조사했지만, 단핵구 매개 반응의 분자 세부 사항은 크게 알려지지 않은6,7, 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. 면역 세포 조절 및 기능에 관여하는 인자 들 중에서, microRNAs (miRNAs), 유전자 발현 후 전사적으로 조절되는 짧은 비코딩 RNA는, 주요 세포 경로의 맥락에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (즉, 성장, 분화, 개발, 및 세포 자멸)20. 이들 분자는대식세포(21)의기능적 편광을 지시하는 데 필수적인 전사 인자의 중요한 조절자로 기술되었다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에서 단핵구에 있는 miRNAs의 잠재적인 역할은 조사되었습니다, 그러나 필드에 있는 진행은22,23,24,25,26를훨씬 더 필요로 합니다 . 이 논문에서는 HIV 에 감염된 환자 및 대조군으로부터 1차 인간 단핵구로 miRNAs 및 siRNAs를 트랜스펙트하는 최적화된 방법에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 시판되는 시약과 키트에 의존하며, 기술 절차의 연속성은 임상 샘플로 작업할 때 불필요한 실험 변수를 제거하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고, 상기 방법은 중요한 팁(즉, 플레이트에 대한 세포의 순착을 촉진하기 위해 무혈청 매체로 도금된 세포 의 수 또는 간략한 인큐베이션)를 제공한다. 또한, 이 프로토콜에 사용되는 편광 조건은 출판된 작업27,28,29에서파생된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5M EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K2EDTA</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Stain Buffer</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563794</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 PerCP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>46-0149-42</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163 BV711</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>563889</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD209 BV421</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>564127</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80 FITC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>557226</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD83 APC</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>551073</td>
			<td>Flow cytometry- conjugated antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy 50 EasySep Magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Sep Direct Human Monocyte Isolation Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9644</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EIF4EBP1 siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-29594</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum Defined Heat Inactivated</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B43618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH mAb</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-47724</td>
			<td>Monoclonal antibody for Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HuFcR Binding Inhibitor</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>14-9161-73</td>
			<td>Flow cytometry- blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B16406</td>
			<td>Software to analyze flow cytometry data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRCURY LNA microRNA Mimic hsa-miR-146a-5p</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>YM00472124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MISSION miRNA Negative Control</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HMC0002</td>
			<td>Scrambled miRNA conjugated with a near infrared dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 35mm Cell Culture Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IFN-&#947;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>285-IF-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human IL-4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>204-IL-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human M-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>216-MC-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 with L-Glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10040CVMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled Control siRNA</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-37007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viromer Blue Transfection Reagent Kit</td>
			<td>Lipocalyx</td>
			<td>VB-01LB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WST-1 Cell Proliferation Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td>Colorimetric assay to assess cell viability</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, transfection, and culture of primary human monocytes

인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)는 1990 년대 중반에 결합 된 항 레트로 바이러스 치료 (cART)의 도입에도 불구하고 주요 건강 관심사로 남아 있습니다. 항레트로바이러스 요법은 전신 바이러스 부하를 효율적으로 낮추고 정상적인 CD4+ T 세포 수를 회복시키지만 완전히 기능적인 면역 체계를 재구성하지는 않습니다. cART를 겪고 있는 HIV 감염한 개별에 있는 역기능 면역 계통은 면역 성 활성화, 면역 세포의 조기 노화, 또는 지속적인 염증에 의해 특징지어질 수 있습니다. 이러한 조건은 HIV 감염과 관련된 comorbid 요인과 함께 세포 및 동물 모델에서 쉽게 재현 할 수없는 질병에 복잡성을 추가합니다. 이 환자에 있는 면역 기능 장애의 근본적인 분자 사건을 조사하기 위하여는, 시험관에서 인간 1 차적인 단핵구를 문화로 조작하는 체계는 여기에서 제시됩니다. 구체적으로, 이 프로토콜은 HIV 음성 대조군뿐만 아니라 CART를 받은 HIV 감염 개인으로부터 얻은 1차 CD14+ 단핵구의 배양 및 형질감염을 허용한다. 이 방법은 단핵구 및 단핵구 유래 대식세포의 격리, 배양 및 형질취득을 포함합니다. 시판되는 키트와 시약이 사용되는 동안, 프로토콜은 miRNA 모방 및 억제제뿐만 아니라 siRNAs와 단핵구의 성공적인 준수 및 형질감염을위한 중요한 팁과 최적화 된 조건을 제공합니다.

설명된 절차를 사용하여, HIV에 감염된 개별 및 건강한 기증자에게서 1 차적인 인간 단핵구는 격리되었습니다. 여기에 제시된 모든 데이터는 낮은(&20 카피/mL) 또는 탐지할 수 없는 바이러스 부하 및 일반 CD4+ T 세포 수로 cART를 받는 HIV+ 피험자로부터 얻어졌습니다. 격리 직후, 세포를 염색하고, 세포 집단의 순도를 확인하기 위해 유세포측정을 수행하였다. ?...

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Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...

HIV 감염은 검출 가능한 바이러스없이 항 레트로 바이러스 치료를 받는 개인에서도 면역 기능 장애를 일으킵니다. 이 방법은 면역 반응의 주요 조절기인 단세포 기능의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 인간의 기본 단핵구의 격리, 문화 및 트랜스퍼팅을 위해 이 기술을 최적화했습니다.우리는 HIV 감염한 개별에 있는 면역 기능 장애의 분자 기계장치를 이해하기 위하여 이 방법을 이용합니다, 그러나 단색세포와 관련되었던 그밖 면역 연구 결과에 적용될 수 있습니다. 이것이 인간의 혈액으로 일하는 첫번째 시간인 경우에, 적당한 생물안전 프로토콜을 따르고 가능하게 전염성 물질로 견본전부를 취급하는 것을 기억하십시오. 4개의 10 밀리리터 EDTA 진공 관에서 40밀리리터의 신선한 인간 전혈을 수집한 후, 멸균 기술을 사용하여 모든 혈액을 생물 안전 캐비닛에 있는 50밀리리터 원추형 프로필렌 튜브로 이송합니다.선택한 인간 단화 절연 키트의 제조업체의 지시에 따라 키트에서 혈액 튜브에 단핵 분리 칵테일 2 밀리리터를 추가하고 키트에서 자기 구슬을 30초 동안 소용돌이시다. 두 밀리리터의 구슬을 혈액에 넣고 25밀리리터 세로지피펫을 사용하여 구슬을 혈액과 조심스럽게 섞습니다. 실온에서 5분 후, 혈액을 50밀리리터 튜브 4개 사이에 균등하게 분할하고 각 튜브에 1밀리미터 EDTA로 보충된 멸균 PBS 30밀리리터를 추가합니다.플라스틱 25 밀리리터 세로지오피펫과 다시 섞어 튜브를 자기 홀더에 놓습니다. 10분 후, 파이펫을 사용하여 각 튜브의 중앙에서 1밀리리터 이상의 적혈구를 흡인하지 않도록 주의하고 튜브 내용물 4개를 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 분배합니다. 각 튜브에 소용돌이가 있는 자기 구슬의 500마이크로리터를 추가하고 세포 용액을 부드럽게 혼합합니다.튜브를 5분 동안 자기 홀더에 다시 넣은 후 각 튜브의 중앙에서 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 중 하나로 조심스럽게 내용물의 내용을 전달합니다. 모든 세포 현탁액이 전달되면 각 새로운 50 밀리리터 튜브를 자석 홀더에 5분 간 배치한 후 튜브 내용내용을 4개의 새로운 50밀리리터 튜브 의 세 번째 세트로 조심스럽게 옮기십시오. 그런 다음 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 계산을위한 멸균 PBS의 총 10 밀리리터에서 모든 4 개의 세포 펠릿을 재중단합니다.계산 후, 37섭씨 37도의 혈청 프리 RPMI 1640 배지의 밀리리터 당 10번에서 6번째 세포로 1회 10회에서 분리된 단핵구를 재연하여 항생제로 보충하고 생물안전 성 캐비닛에 있는 35mm 플레이트로 재중단된 세포의 1밀리리터를 플레이트로 플레이트한다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 30-60분 동안 배치하여 세포가 우물 바닥에 부착할 수 있도록 합니다. M1과 같은 표현형을 가진 대식세포에 대한 프라이머, 각 접시에 GM-CSF의 밀리리터 당 25 나노그램을 포함하는 태아 소 혈청의 100 마이크로 리터를 추가합니다.M2와 같은 표현형을 가진 대식세포에 대한 프라이머, 각 플레이트에 M-CSF의 밀리리터 당 50 나노그램을 포함하는 태아 소의 100 마이크로 리터를 추가합니다. microRNA 모방, 억제제 또는 작은 간섭 RNA를 가진 단핵 환전의 경우, 트랜스페션 키트에 대한 제조업체의 프로토콜에 따라, 10 마이크로리터의 희석 모방 또는 제5 세포의 10 마이크로리터에서 완충제에서 선택된 RNA를 희석시켰다. 경질 시약을 준비하기 위해 제공된 폴리머의 마이크로리터 1개를 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브에 추가하고 즉시 키트 제공 버퍼의 90 마이크로리터를 추가하여 트랜지션당 총 91마이크로리터의 시약을 얻습니다.3~5초 동안 리젠트를 소용돌이시키고 희석 된 RNA 10 마이크로리터를 포함하는 튜브내로 전환 용액의 파이펫 90 마이크로리터를 소용돌이시다. 부드러운 혼합 후 실온에서 15분 동안 용액을 배양한 후 100마이크로리터의 트랜스페션 복합체를 하나의 셀에 추가합니다. 섭씨 37도에서 4시간 후, 배지를 적절한 성장 인자를 포함하는 완전한 중간 크기의 3밀리리터로 교체하십시오.문화의 여섯 날에, 태아 소 세럼, 항생제, 리포 폴리사카라이드, 인터페론 감마로 보충 된 매체의 3 밀리리터로 M1 배양 문화 의 초월제를 대체하고 태아 소 혈청, 항생제, M-CSF, 및 인터루크4로 보충 매체로 M2 문화권에서 초퍼를 대체합니다. 24시간 의 배양 후, 활성화된 대식세포 의 각 플레이트를 세척당 신선한 PBS로 두 번 씻으시면 씻습니다. RNA 및 단백질 분석을 위해, 부착된 세포를 플레이트에 직접 리세하여 분석을 위해 방출된 세포 내용물의 수집을 허용한다.유동 세포 측정 분석을 위해 PBS에서 밀리머 EDTA 2개를 10분 동안 섭씨 37도에서 분리한 후 플레이트 바닥에서 세포를 부드럽게 긁어 내어 수집을 1.5 밀리리터 미세원심분리기로 분석합니다. 여기서 는 비활성화 T0 세포에 비해 CD163 및 CD209의 증가된 수준을 가진 CD80 및 CD83 및 M2 활성화 세포의 증가된 수준을 가진 M1 활성화 제어 및 환자 유래 세포의 대표적인 히스토그램이 도시된다. 흥미롭게도, CD80 및 CD83은 HIV 유래 세포에 비해 대조군 유래 세포에서 더 높게 발현되는 것으로 나타났다.스크램블근적외선 표지 된 microRNA를 사용하여 갓 수집 된 단핵구의 트랜스페션은 유동 세포 측정 및 공초점 현미경 검사법에 의해 결정된 바와 같이 90 % 이상의 트랜스페션 효율을 초래합니다. 또한, 형질전환은 세포 성숙 또는 경질 조건의 단계에 관계없이 환자 유래 또는 제어 세포의 생존가능성을 크게 감소시키지 않는다. 트랜스펙트 결과 1일 및 4일째 사후 격리에서 특정 소형 간섭 RNA를 통해 트랜스포팅 시 표적 유전자의 효과적인 다운레충이 초래됩니다.또한, microRNA 모방으로 감염된 세포는 모든 트랜스퍼션 컨트롤이 유의할 수 없는 변화를 보이지 않는 동안, 미감염 된 세포에 대한 microRNA 발현의 48 ~ 72 배 증가를 입증한다. 도금된 세포의 수는 생존에 매우 중요합니다. 35mm 접시당 100만 개의 셀을 권장합니다.혈청이 없는 배지로 도금도 세포 부착을 크게 향상시킬 것입니다. 이 방법으로 얻은 세포는 관심있는 환자와 건강한 통제의 환자에 있는 차동 반응을 공부하기 위하여 사이토카인 또는 성장 인자로 취급될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

기본 인적 Keratinocytes에서 Organotypic 뗏목 문화의 생성

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...